慢病毒載體
——重組蛋白高效表達(dá)的新契機(jī)

周鵬高洋杜紅延★李紅衛(wèi)★

慢病毒載體
——重組蛋白高效表達(dá)的新契機(jī)

周鵬1高洋2杜紅延2★李紅衛(wèi)2★

隨著生命科學(xué)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，人們對于重組蛋白的需求越來越大，所以構(gòu)建一種能夠大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白的系統(tǒng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。而通過慢病毒（Lentivirus）來提高重組蛋白的產(chǎn)量可能會是一種十分有效的方法。由于其擁有的優(yōu)良特性，慢病毒系統(tǒng)被廣泛關(guān)注，已經(jīng)被應(yīng)用于許多領(lǐng)域。本文對近年來有關(guān)慢病毒系統(tǒng)在外源重組蛋白表達(dá)方面的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。將慢病毒應(yīng)用于外源重組蛋白的表達(dá)，將會為外源蛋白的高效表達(dá)提供新的契機(jī)。

慢病毒；慢病毒載體；高效表達(dá)

1 慢病毒載體

慢病毒載體（Lentiviral vector，LV）是指來源于人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV），并在此基礎(chǔ)上發(fā)展的一種基因操作病毒載體。將人類免疫缺陷病毒進(jìn)行基因改良并用于轉(zhuǎn)基因的研究已經(jīng)超過了20年。早期的HIV經(jīng)過持續(xù)改進(jìn)，目前已發(fā)展成為安全、有效的慢病毒載體。慢病毒載體現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)生物學(xué)的很多領(lǐng)域：轉(zhuǎn)基因，重組蛋白過表達(dá)，持久性的基因沉默，免疫學(xué)，體內(nèi)成像，轉(zhuǎn)基因動物，誘導(dǎo)多能細(xì)胞，干細(xì)胞修飾，譜系追蹤以及定點(diǎn)基因剪接等[1]。

慢病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，使用逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）和整合酶（integrase，IN）可將自身的病毒基因信息穩(wěn)定的插入宿主基因組。慢病毒有自己特定的宿主，例如人類、猴子、貓、馬、牛、山羊和綿羊，對于不同物種有不同的特性、受體和致病性。慢病毒常能導(dǎo)致慢性疾病，例如免疫缺陷、貧血、肺炎、腦炎[2～5]。該病毒屬除了HIV外還有猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）、馬傳染性貧血（equine infectious anemia，EIA）和貓免疫缺陷病毒（feline immunodeficiency virus，F(xiàn)IV）。與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，慢病毒不僅能感染分裂細(xì)胞，還能感染非分裂細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制[6]，因此改良的慢病毒系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于各種類型細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肌細(xì)胞、胰島細(xì)胞等[7～12]。

同時作為一種轉(zhuǎn)基因載體，慢病毒有很多優(yōu)良特性：（1）能與宿主基因組穩(wěn)定整合，從而獲得持久性的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)；（2）對于分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞都有感染能力；（3）廣泛的組織嗜性。包括一些基因治療和細(xì)胞治療的靶細(xì)胞；（4）在轉(zhuǎn)導(dǎo)之后不會表達(dá)病毒的蛋白質(zhì)，細(xì)胞毒性小，宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)小；（5）能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)雜的遺傳因子,如多順反子和基因內(nèi)區(qū)包含序列；（6）整合位點(diǎn)的安全性可能更高；（7）載體的操作和生產(chǎn)相對容易[1,13]。

由于大多數(shù)的慢病毒載體都是基于HIV-1，所以這里就以HIV-1為例來介紹慢病毒載體的一些基本信息。HIV-1基因組是兩條相同的正鏈RNA，每條長約9.2～9.8 kb。其中最大的三個開放閱讀框架（Gag，Pol和Env）編碼了它最主要的結(jié)構(gòu)蛋白：Gag編碼病毒核心蛋白，Pol編碼病毒復(fù)制所需要的酶，Env編碼病毒表面糖蛋白gp160。gp160可以裂解為gp120和gp41，這兩種蛋白對于HIV-1感染CD4細(xì)胞是必不可少的[1,14]。到目前為止，慢病毒載體已經(jīng)發(fā)展了四代，從第一代的安全性低并只能感染CD4細(xì)胞的載體，到第四代的安全性高、無組織選擇性的可調(diào)控性慢病毒載體[1,13]。研究者對新一代慢病毒的改良研發(fā)工作仍在進(jìn)行，相信其前景十分廣闊。

2 慢病毒載體表達(dá)重組蛋白質(zhì)的高效性

隨著基礎(chǔ)研究以及臨床應(yīng)用的發(fā)展，作為許多藥物主要成分的重組蛋白需求量日益增多。但是，長期以來利用真核表達(dá)系統(tǒng)快速大量表達(dá)重組蛋白的技術(shù)仍是一個科學(xué)性難題。

最常用的重組蛋白原核生產(chǎn)系統(tǒng)是大腸桿菌（E.coli），它簡單、快捷、成本低而且能夠滿足大多數(shù)需要。然而原核系統(tǒng)在生產(chǎn)真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)時，存在嚴(yán)重的局限性。例如細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)沒有能力執(zhí)行轉(zhuǎn)錄后修飾的折疊、糖基化、磷酸化，導(dǎo)致其產(chǎn)物生物活性不足[15,16]。此外重組蛋白的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)也會使用真菌和昆蟲細(xì)胞，真菌系統(tǒng)在產(chǎn)量方面較細(xì)菌有優(yōu)勢，且能成功表達(dá)復(fù)雜蛋白質(zhì)，甚至還能部分表現(xiàn)出翻譯后修飾，但糖基化等修飾卻和哺乳動物不同[17,18]。同樣，昆蟲細(xì)胞也不能準(zhǔn)確的表達(dá)復(fù)雜的哺乳動物蛋白的糖基化[19]。因此，用于生物研究的重組蛋白最好是由哺乳動物細(xì)胞系生產(chǎn)，現(xiàn)在最常用的是嚙齒動物細(xì)胞和人體細(xì)胞，比如中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary，CHO），幼倉鼠腎細(xì)胞（baby hamster kidney，BHK），人胚腎細(xì)胞（human embryonic kidney，HEK）293。大約70%商業(yè)化生產(chǎn)的重組蛋白來自于CHO[20]，因為CHO有著出色的適應(yīng)性以及遺傳可塑性[21,22]，而且CHO細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)到非常高的密度，從而能夠在生物反應(yīng)器中擴(kuò)大增殖[23]。Gaillet等[24]在實(shí)驗室開發(fā)出一種基于腺病毒感染的新方法，用于改善在CHO細(xì)胞瞬時表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)量，在非最佳條件下，他們所用的腺病毒系統(tǒng)可以生產(chǎn)高達(dá)65 μg/mL的分泌型堿性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase，SEAP）。雖然CHO細(xì)胞的應(yīng)用已十分廣泛，但也不夠理想，因為其表達(dá)的產(chǎn)物可能成為過敏原從而引起臨床副作用，而且生產(chǎn)水平也通常低于HEK293細(xì)胞[25～29]。

慢病毒能夠感染各種分裂和非分裂的細(xì)胞，并且能有效穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞的基因組染色體，使用慢病毒來轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因為外源蛋白的高效表達(dá)提供了新的思路。與其他載體相比較，慢病毒載體擁有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與基因表達(dá)效率。HIV-1在逆轉(zhuǎn)錄的過程中，正鏈DNA是從中央多嘌呤序列（central polypurine tract，cPPT）開始合成的。有研究表明，在慢病毒載體中引入順式作用的cPPT，可以有效提高慢病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[30]。另外一種順式作用元件是土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件 （woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element，WPRE）。WPRE可以增加細(xì)胞核與胞漿的未剪接RNA濃度，所以在慢病毒載體中引入WPRE可以顯著增強(qiáng)目標(biāo)細(xì)胞中外源基因的表達(dá)[31]。可是WPRE含有截斷的土撥鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus，WHV）X基因，這有可能導(dǎo)致動物發(fā)生肝癌[32]，但通過對X基因的開放閱讀框架的突變，WPRE的安全性得到很大的提升[33]。

Gaillet等[34]利用慢病毒與CHO構(gòu)建一個能夠快速大量生產(chǎn)重組蛋白的系統(tǒng)，使蛋白產(chǎn)量達(dá)到了毫克水平并證明了此系統(tǒng)的有效性。在對初始濃度為1.5×106cells/mL的CHO-Cum2細(xì)胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，重組蛋白的產(chǎn)量可以達(dá)到160～235 μg/mL，這在CHO細(xì)胞沒有濃縮和復(fù)制的情況下是一個相當(dāng)高的產(chǎn)量。隨著CHO細(xì)胞培養(yǎng)的改進(jìn)，可以設(shè)想此系統(tǒng)在細(xì)胞初始濃度高于107cells/mL時，其重組蛋白的產(chǎn)量可以達(dá)到1 mg/mL，并且他們也驗證了此系統(tǒng)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)序列沒有明顯的改變，該系統(tǒng)的主要限制是需要高滴度的慢病毒載體。

研究中還發(fā)現(xiàn)，慢病毒的包裝大小存在限制性，只有在10 kd DNA左右有效率，否則已整合的慢病毒就存在著基因沉默的可能性。針對這個問題，Bandaranayake等[35]在他們設(shè)計的重組蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)（Daedalus）中，通過構(gòu)建一個0.7 kd的染色質(zhì)開放元素（ubiquitous chromatin opening elements，UCOE）并導(dǎo)入了慢病毒載體，將慢病毒的包裝大小穩(wěn)定的提高到了接近70 kd。Daedalus系統(tǒng)是由慢病毒載體與293-F細(xì)胞組成，使用分泌途徑生產(chǎn)，從而使初始轉(zhuǎn)導(dǎo)率更有效，并大大降低了純化蛋白質(zhì)的難度。他們在傳統(tǒng)的100 mL規(guī)模的培養(yǎng)基中，以5×105cells/mL為初始濃度，表達(dá)出12種蛋白質(zhì)，其表達(dá)量在20～100 mg/L之間，而且所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)只需要一步層析法就能快速方便的純化。

3 慢病毒載體在疾病治療方面的應(yīng)用

有些疾病是由體內(nèi)某種蛋白質(zhì)表達(dá)不足或者錯誤表達(dá)所引起的，如果把慢病毒應(yīng)用于高效表達(dá)這些蛋白質(zhì)，將會給這些疾病的防治帶來很大的益處。

3.1 在造血系統(tǒng)疾病的應(yīng)用

血友病A是由凝血因子VIII缺乏所引起的，是臨床上最常見的血友病。目前已有使用慢病毒載體高效表達(dá)人類重組凝血因子VIII的報道，Spencer等[36]使用BHK細(xì)胞來表達(dá)凝血因子VIII，最終可使速率達(dá)到每天每細(xì)胞表達(dá)9 pg，表達(dá)總量達(dá)到2.5 mg/L。而且所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一致并在血友病小鼠體內(nèi)證明有效。除了表達(dá)效率高之外，他們還有效降低了產(chǎn)物的免疫原性，延長了半衰期。da Rosa等[37]使用慢病毒表達(dá)載體在人肝癌細(xì)胞株中成功表達(dá)重組凝血因子VIII，使凝血因子VIII的產(chǎn)量達(dá)到了每天1.5～2.1 IU/106cell，并也在血友病小鼠體內(nèi)證明了產(chǎn)物的有效性。他們的研究為血友病的治療提供了一個新的機(jī)遇。

3.2 在心血管系統(tǒng)疾病的應(yīng)用

動脈粥樣硬化與高血脂關(guān)系密切，而使用慢病毒降低血脂也有報道。在2008年一篇報道中，研究人員將攜帶載脂蛋白（apolipoprotein，Apo）AL的慢病毒載體對造血祖細(xì)胞與巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后移植入apoE-/-的小鼠體內(nèi)，結(jié)果不僅提高了表達(dá)量，還能使動脈粥樣硬化的損害區(qū)域降低50%[38]。另外也有一篇使用慢病毒與泡沫細(xì)胞表達(dá)脂聯(lián)素的報道，表明脂聯(lián)素可以有效降低氧化低密度脂蛋白（oxygenized low density lipoprotein，oxLDL）的攝取，提高高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）介導(dǎo)的膽固醇外流，從而可以有效防控動脈粥樣硬化，研究人員通過慢病毒感染人類泡沫細(xì)胞來高效表達(dá)脂聯(lián)素，結(jié)果成功的減少了脂肪堆積[39]。

3.3 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用

Tau蛋白在阿爾茨海默癥（Alzheimer disease，AD）發(fā)病中有重要作用，Caillierez等[40]使用慢病毒向大鼠的海馬體轉(zhuǎn)導(dǎo)六種人類Tau蛋白基因，利用大量表達(dá)出的Tau蛋白制作出不同的神經(jīng)元纖維變性的模型，使AD的研究又前進(jìn)了一步。帕金森病（Parkinson's disease，PD）的一個主要病理改變是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）可以保護(hù)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，Georgievska等[41]在大鼠紋狀體中使用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)并高效表達(dá)GDNF，能使黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損害降低65～77%，為PD的相關(guān)研究以及治療提供了有價值的結(jié)果。

3.4 在內(nèi)分泌疾病的應(yīng)用

侏儒癥是由生長激素缺乏所引起的，有人曾構(gòu)建可以有效的表達(dá)人類生長激素（human growth hormone，HGH）的慢病毒載體，通過感染小鼠的成肌細(xì)胞，最終使持續(xù)表達(dá)的時間達(dá)到了8周以上，成功讓他們的載體可以長期持續(xù)地表達(dá)[42]。有研究表明胰島素作用于大腦中央杏仁核可能會引起厭食反應(yīng)[43]，Park-York等[44]使用慢病毒在大鼠杏仁核轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白激酶（proteinkinases，PK）Cθ，使PKCθ過表達(dá)，他們發(fā)現(xiàn)PKCθ可以降低胰島素對杏仁核的敏感性，從而改善胰島素所引起的厭食反應(yīng)。

3.5 在其他方面的應(yīng)用

Martignani等[45]在他們的牛乳腺上皮干細(xì)胞中使用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)人類β-酪蛋白，也獲得一定的產(chǎn)量。另外，對于慢病毒可以減少基因毒性的特性也有報道，Lachmann 等[46]使用慢病毒在體內(nèi)表達(dá)胞嘧啶脫氨酶，可以降低其對骨髓的毒性。

4 總結(jié)與展望

對于重組蛋白質(zhì)與日俱增的需求量促進(jìn)了相關(guān)科學(xué)研究的進(jìn)步，但目前的方法都難以真正滿足需求。所以重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)的產(chǎn)量可謂是多多益善，這也意味著此項研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有走到盡頭，仍有很長的路需要探索。而重組蛋白的產(chǎn)量越大，意味著產(chǎn)生蛋白質(zhì)的成本越低，將為臨床和科研帶來潛在的經(jīng)濟(jì)效益。因此，探索提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的方法在今后很長一段時間內(nèi)仍將是科學(xué)研究中很有價值的一部分，而因為擁有許多優(yōu)良特性，慢病毒載體可能會成為提高重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量的一種有效方法。

作為一種新型病毒載體，慢病毒比起其他載體有許多明顯的優(yōu)勢，越來越多的研究開始使用慢病毒作為其轉(zhuǎn)基因的載體。隨著相關(guān)生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，現(xiàn)今已可以購買到隨時可用的慢病毒，使用更加方便。由于能夠攜帶復(fù)雜的外源基因，所以將慢病毒載體用于表達(dá)復(fù)雜的治療性蛋白質(zhì)很有臨床意義。甚至可以設(shè)想利用慢病毒表達(dá)率高，表達(dá)準(zhǔn)確，表達(dá)持續(xù)時間長等優(yōu)勢直接進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，采用基因治療方式來治療某些疾病，可能會是一種一勞永逸的方法。可以預(yù)見，慢病毒載體的應(yīng)用將會更加廣泛。

然而，慢病毒仍有一些不足。例如對插入外源性基因的大小依然存在限制性，難以表達(dá)大型蛋白質(zhì)；雖然慢病毒的免疫原性較小，但仍有可能在體內(nèi)引起免疫反應(yīng)[47]，而且慢病毒也有可能激活宿主細(xì)胞的Toll樣受體（toll-like receptors，TLR）9基因，這也限制了慢病毒在臨床方面的應(yīng)用[48]；甚至存在著表達(dá)出無活性產(chǎn)物的可能性，Geering等[49]在他們的研究中發(fā)現(xiàn)使用中性粒細(xì)胞與慢病毒載體表達(dá)出的死亡相關(guān)蛋白激酶（death associated protein kinase，DAPK）2在細(xì)胞中沒有活性。此外還有一點(diǎn)需要指出，慢病毒載體是由致病的病毒改造而來，盡管慢病毒載體的安全性得到極大的提升，卻仍然不能完全排除產(chǎn)生可復(fù)制病毒的可能性。隨著研究的深入與方法的改進(jìn)，慢病毒的缺陷也正在逐漸改善，因此，對于慢病毒載體的改進(jìn)也會是一項有前景的研究。

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Lentiviral vectors: a new opportunity of high-level recombinant protein expression

ZHOU Peng1, GAO Yang2, DU Hongyan2★, LI Hongwei2★
(1.The First Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China; 2.School of Biotechnology, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China)

The demand for the recombinant protein is increasing with the development of life science industry and it is a current research hotspot to build a system which can produce high-level recombinant proteins. And it could be a very effective method to improve the production of recombinant protein by the application of lentiviral vectors. Because of several excellent properties, the lentiviral vectors have been widely used. We review the recent applications of recombinant protein expression by using lentiviral system. And the lentiviral vectors would provide a new opportunity to express high-level recombinant proteins.

Lentivirus; Lentiviral vector; High-level recombinant protein production

國家自然科學(xué)基金（81072113）；國家863項目（2012AA020205）；生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗室開放課題（SKIPBS1103）；南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究前期啟動項目（B1012076）

1.南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東，廣州 510515 2.南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州 510515

★通訊作者：杜紅延，李紅衛(wèi)，E-mail:gzduhongyan@126.com

注：杜紅延，李紅衛(wèi)為共同通訊作者