高效液相色譜法測定散結止痛顆粒中芍藥苷含量

袁繼承　沙啟營　呂偉斌　袁繼魯

散結止痛顆粒(批準文號：魯藥制字再Z17080034)是菏澤市中醫醫院一種主治各種乳腺增生的中藥制劑，具有理氣活血、散結止痛的功效，適用于治療氣滯血瘀痰凝而致的乳房脹痛、乳腫結塊等各種類型的乳腺增生疾病。該醫院制劑已使用多年，臨床療效好，具有開發上市前景。

散結止痛顆粒全方由香附、赤芍、當歸、柴胡等共十六味中藥組成，赤芍為本制劑的君藥，具有清熱涼血、散瘀止痛功效。赤芍總苷具有較強的清除自由基和抗凝血活性[1]；其中芍藥苷(paeoniflorin)是赤芍總苷的主要活性成分，在總苷中含量占75%以上[2]，具有多種生物作用，如抗菌抗炎、調節免疫功能[3-4]，所以測定芍藥苷含量可以控制該制劑的內在質量。由此建立了測定散結止痛顆粒中芍藥苷含量的高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)。

1　儀器與試藥

日本島津LC-10ATVP液相色譜儀，SPD-10Avp紫外檢測器；KQ-250E型醫用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius BP211D電子天平。

芍藥苷(批號：110736-200525)購于中國藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純；水為純凈水；散結止痛顆粒樣品均為菏澤市中醫醫院制劑科自制。

2　方法與結果

2.1　色譜條件與系統適應性試驗[5]

色譜柱：依利特Hypersil ODS2 高效液相色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動相：乙睛—水(17：83)；流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫；檢測波長：230 nm；芍藥苷的理論塔板數不低于3000。經過多種芍藥苷的測定方法實驗比較，本方法對芍藥苷分離效果好，同時陰性樣品無干擾，且洗脫時間短，因此，最終采用上述芍藥苷的高效液相色譜條件。

2.2　對照品溶液及標準曲線制備

精密稱取芍藥苷對照品5.24 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得濃度為0.524 mg/ml的芍藥苷對照品儲備溶液。取對照品儲備溶液2.5 ml，置于5 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為262.0 mg/ml的芍藥苷對照品溶液。

芍藥苷標準曲線制備：精密吸取配制的芍藥苷對照品儲備溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2 ml，分別置于2 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列濃度為52.4、104.8、157.2、209.6、262.0、393.0、524.0 μg/ml的芍藥苷對照品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，進樣10 μl于色譜儀中測定。結果芍藥苷濃度在52.4～524 μg/ml范圍內與峰面積有良好的線性關系，以峰面積(Y)為縱坐標，濃度(X)為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程：Y=6341.9X+76190，r=0.9999。

2.3　供試品溶液制備

精密稱定2.0 g散結止痛顆粒(批號：20100503)，用50 ml甲醇為溶劑分兩次進行超聲提取，每次超聲15分鐘，放冷，稱重，濾過，得續濾液于蒸發皿中水浴蒸干，定量轉移至10 ml容量瓶中，用流動相定容至刻度即得供試品溶液。

2.4　專屬性試驗

根據處方中各藥味的比例，按照散結止痛顆粒制備工藝制備不含赤芍的顆粒，按照供試品提取條件及制備方法配制空白溶液，用高效液相色譜法測定，結果該空白溶液與散結止痛顆粒溶液的HPLC色譜圖在相應的保留時間無吸收，表明該方法對散結止痛顆粒中芍藥苷的測定具有專屬性，可以用于散結止痛顆粒的芍藥苷含量測定(見圖1)。

2.5　對照品和樣品穩定性試驗

取芍藥苷對照品溶液和供試品溶液分別于配制后1小時、24小時、48小時分別連續3次依法測定峰面積，結果表明，對照品溶液和供試品溶液在48小時內穩定。

2.6　精密度試驗

精密吸取濃度為262.0 μg/ml的對照品溶液10 μl于色譜儀中，重復進樣5次，計算其峰面積的RSD為0.44%，表明精密度較好。

2.7　重現性試驗

取同一批散結止痛顆粒5份，按照2.2方法測定樣品中芍藥苷含量，計算樣品RSD為2.80%，表明重現性良好。

2.8　回收率試驗

精密稱取己知含量的同一批散結止痛顆粒6份，分別精密加入一定量的芍藥苷儲備液，用供試品溶液方法提取濃縮，定量轉移至5 ml容量瓶中，用流動相定容至刻度。依法測定，并計算回收率, 平均回收率為99.76%，RSD為4.68%。表明本法具有良好的回收率。

2.9　樣品測定結果

取5批次散結止痛顆粒樣品，按照所述方法進行芍藥苷測定含量，每批3次，結果見表1。

表1　5批樣品中芍藥苷含量測定結果

根據中國藥典2010年版一部對赤芍藥材中芍藥苷不得少于1.8 %的規定，結合制備的5批樣品中芍藥苷的含量測定結果，最低含量1.42 mg/g，最高含量2.15 mg/g，故初步暫定散結止痛顆粒中芍藥苷(C23H28O11)的含量不得小于1.5 mg/g。每袋裝量12 g，則本品含芍藥苷的量每袋不小于18.0 mg。

3　討論

本實驗流動相系統的確定時，分別考察了甲醇—水、甲醇—0.1%磷酸溶液兩種流動相[6]，結果芍藥苷分離不完全，受到其他成分一定的干擾，且峰型不好，故選擇乙腈—水系統，確定乙腈—水溶液(17∶83)為流動相時，芍藥苷的分離度、峰型均較好，符合測定含量的要求。

在制備供試品溶液的提取方法中，分別考察了提取方法和時間、提取次數、提取溶劑及其使用量對芍藥苷的影響。首先參考相關文獻[7]初步采用甲醇提取芍藥苷，在提取方法選擇上，結果超聲提取比回流提取簡單易操作，并可以達到提取完全的

目的，故采用超聲提取方法；在超聲時間和溶媒用量上，通過多次試驗，結果50 ml甲醇分兩次提取，每次超聲15分鐘即可將芍藥苷提取完全。

該醫院制劑成分復雜，多年臨床應用證明其安全、有效，但其質量標準僅對成品進行兩味藥材定性鑒別，未建立中間產品及成品定量檢測控制標準。為保證藥品質量，本試驗建立的散結止痛顆粒中芍藥苷含量測定方法簡便、準確、結果可靠，能有效地控制散結止痛顆粒的質量，保證了臨床療效的穩定，并可為進一步申報中藥新藥做好準備。

[1]樸田,莫曉燕,林瑞崢.赤芍總苷提取液體外清除自由基和抗凝血活性的研究[J].中國藥房,2007,19(9),643-646.

[2]馬雙成,鄧少偉.赤芍總苷的生產工藝條件研究[J].中草藥,1998,29(10):664．

[3]華東,吳明媛,于曉紅,等.赤芍總苷對荷瘤鼠細胞免疫功能的影響[J].中醫藥學報,2004,32(1):47.

[4]王曉玉,魏偉,唐麗琴,等.芍藥苷對佐劑性關節炎大鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能及其產生細胞因子的影響[J].安徽醫科大學學報,2007,42(2):191-192.

[5]吳洪文,李明艷.高效液相色譜法測定蝎龍酒中芍藥苷的含量[J].中國醫院藥學雜志,2010,30(17):1486.

[6]侯林中,裴玉書,張熙潔,等.HPLC法測定寬心口服液中芍藥苷的含量[J].中國藥房,2011,22(31),2933-2934.

[7]李文博,韓建平,倪倩,等.SPE-UPLC法測定養血清腦顆粒中的芍藥苷含量[J].藥物分析雜志,2011,31(7):1385-1388.