軟肝寧對大鼠肝纖維化的保護作用研究

閆 冰，周曉輝，王曙東

（中國人民解放軍南京軍區南京總醫院，江蘇 南京 210002）

肝纖維化是一切慢性肝病的病理學基礎，是形成肝硬化的必經階段[1]。因此，抗肝纖維化已成為慢性肝病的重要治療環節[2]。軟肝寧選用黨參、姜黃、枸杞子、郁金、山芋肉等9味中藥組方，長期應用于臨床。為探討其作用機制，本研究中通過四氯化碳致肝纖維化大鼠的影響[3]，探討軟肝寧對肝纖維化大鼠的作用機制。

1 材料與方法

1．1 材料

藥物及試劑：四氯化碳（CCl4，分析純，上海凌峰化學試劑有限公司，批號為110524）；秋水仙堿(昆明制藥集團股份有限公司，批號為20110318）；花生油采用普通食用花生油，試驗時配成20%四氯化碳花生油；軟肝寧(選用黨參、姜黃、枸杞子、郁金、山芋肉等9味中藥組成)按人臨床劑量用體表面積法換算成大鼠用量后，分別研磨配制成實驗濃度，按每10 g體重0．1 mL灌胃，1次／天，用時搖勻。AST試劑盒（批號為 20110312）、ALT試劑盒（批號為 20110426）、HA試劑盒（批號為 20110409）、LN 試劑盒（批號為 20110517）、PCⅢ試劑盒（批號為20110322）、HYP試劑盒（批號為20110618）及ALB試劑盒（批號為20110322），均購自南京建成生物工程研究所。

動物：清潔級 Wister雄性大鼠 60只，體重 210～230 g，由南京江寧縣湯山青龍山動物繁殖場提供，實驗動物生產許可證為SCXK（蘇）2010－2011。

1．2 方法

動物分組和造模方法：將60只大鼠隨機分為6組，每組10只。正常對照組(A組)給予生理鹽水。模型組(B組)給予20%四氯化碳花生油溶液按每10 g體重0．1 mL皮下注射，首劑加倍，每5天注射1次，首次注射后，用生理鹽水按每10 g體重0．1 mL灌胃，1次／天，連續 6 周。軟肝寧高、中、低劑量組(C1，C2，C3組)（0．12，0．06，0．03 g／kg）按損傷模型組同法給予CCl4造模，然后給予軟肝寧給藥，1次 ／天，連續給藥 6周。秋水仙堿組(D組)配成 0．01 g／L按60 kg體重10 mg給藥，1次／天，連續給藥6周。

標本取材及預處理：各組動物在造模或給藥后，以10%水合氯醛麻醉，打開腹腔，頸總動脈取血 6 mL，3 000 r／min 4℃離心15 min后，分離血清，－20℃保存待檢。取肝臟，切取左側肝臟組織約5 mm×5 mm×3 mm大小投入10%甲醛固定用作光鏡觀察。

1．3 觀察指標

肝纖維化指標：用放射免疫法分別測定血清透明質酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）與肝組織中羥輔氨酸（HYP）的含量，均按試劑盒說明書操作。

肝功能：用自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬酸氨基轉移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）。

常規病理學觀察：將大鼠肝組織，用10%的福爾馬林溶液固定，肝組織進行石蠟包埋，常規切片，HE染色，光鏡下觀察。

1．4 統計學處理

應用 SPSS 16．0統計軟件，各項數據采取 X±s表示，多組數據間比較采用單因素方差分析進行處理。

2 結果

2．1 肝功能

由表1可見，模型組血清中ALT，AST及MDA的含量較正常對照組明顯升高（P＜0．01），軟肝寧劑量依賴性降低大鼠血清ALT，AST 水平及 MDA 的含量（P＜0．05或 P＜0．01），可提高血清中SOD含量，軟肝寧組中尤以高劑量組作用更為顯著（P＜0．01）。

表 1 各組 ALT，AST，MDA，SOD檢測結果（X ±s，n ＝10）

2．2 肝纖維化指標

由表2可見，CCl4肝損傷模型組大鼠血清中肝纖維化各項指標及肝組織HYP水平明顯高于正常對照組（P＜0．01）。與模型組比較，軟肝寧高、中劑量組與秋水仙堿組可顯著降低血清中HA，LN及肝組織 HYP含量（P＜0．05或 P＜0．01），而低劑量組與模型組比較無統計學意義；軟肝寧高劑量組對降低LN水平及降低PCⅢ含量優于秋水仙堿組（P ＜0．01）。

表 2 各組 HA，HYP，LN，PCⅢ檢測結果（X ±s，n ＝10）

2．3 肝組織病理學結果

病理切片結果表明，正常對照組肝細胞未見變性與壞死，肝內未見纖維組織增生，小葉結構清晰，肝組織正常。CCl4模型組大鼠肝組織結構鏡下可見肝組織損害嚴重，肝小葉結構破壞，有的呈氣球樣變，以環中央靜脈分布的肝細胞灶性或片狀壞死，伴炎性細胞浸潤等病理改變。軟肝寧各劑量組均未出現假小葉的形成，相比較而言，中、高劑量組纖維增生較少，局限于匯管區，低劑量組療效稍差，纖維組織又匯管區向周圍延伸，變形壞死較嚴重；秋水仙堿可較好改善肝纖維化損傷。結果見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色(×100倍)

3 討論

肝纖維化指肝內細胞、纖維及基質的異常增生，纖維結締組織增生的病理過程，是慢性肝病的重要病理階段，也是發展為肝硬化的物質基礎，并且是一可逆階段，其實質是由于膠原和其他細胞外基質的合成和降解失衡，對此階段的干預治療處于防止肝纖維化向肝硬化轉變的關鍵地位[4－5]。

肝纖維化的主要發生機理是由于纖維增生和纖維分解不平衡，引起肝臟纖維結締組織過度沉積所致[6]。目前，對于肝纖維化常用的指標，仍以病理組織學檢查和反映膠原代謝的指標為主。膠原纖維主要由膠原蛋白構成，而羥脯氨酸在膠原蛋白的含量約為14%，所以羥脯氨酸常被認為是膠原蛋白的特有成分，因此測定肝組織羥脯氨酸含量可間接反映肝纖維化的程度。血清中HA，LN，PCⅢ也常用于肝纖維化的診斷，其水平的高低可作為慢性肝組織炎癥壞死、纖維化程度和肝纖維化、肝硬化診斷的重要指標[7－8]。因為SOD是氧自由基的清除劑，肝細胞受到自由基攻擊時，SOD可因其過度消耗而減少，體內SOD活性越高，自由基清除的速度越快。在脂質過氧化反應中，MDA是其分解的終產物之一，其含量反映了機體組織、細胞損傷的程度[9]。本試驗結果顯示，CCl4誘導的慢性肝纖維化大鼠有明顯的肝損傷及慢性肝纖維化表現。給予軟肝寧治療后，軟肝寧可明顯降低肝纖維化大鼠血清中ALT，AST，MDA水平及提高SOD的含量；高、中劑量還能使升高的 HA，LN，PCⅢ及肝組織中HYP水平顯著降低，且病理觀察提示高劑量軟肝寧可以明顯地抑制模型大鼠肝組織膠原纖維的增生，從而減輕肝細胞損傷，說明軟肝寧對CCl4誘導的大鼠肝纖維化有良好的防治作用。

近年來研究證實，中醫中藥在治療此病方面體現出巨大的優勢，成為抗纖維化領域中研究的熱點之一。國內外學者致力于中醫藥抗肝纖維化的研究，發現中藥在抗肝纖維化治療中具有明顯的優勢，包括單味藥，復方的研究[10－11]。軟肝寧是由中藥黨參、姜黃、枸杞子、郁金、山芋肉等9味中藥組成，能延緩四氯化碳造成的大鼠肝纖維化進程，能改善肝功能，抗脂質過氧化，并能抑制假小葉的形成及纖維組織的增生。軟肝寧抗肝纖維化作用機制可能與保護肝細胞、抑制膠原合成、降低轉氨酶、抗脂質過氧化反應及促進機體蛋白質合成等因素有關。

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