軟肝寧對(duì)大鼠肝纖維化的保護(hù)作用研究

閆 冰，周曉輝，王曙東

（中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，江蘇 南京 210002）

肝纖維化是一切慢性肝病的病理學(xué)基礎(chǔ)，是形成肝硬化的必經(jīng)階段[1]。因此，抗肝纖維化已成為慢性肝病的重要治療環(huán)節(jié)[2]。軟肝寧選用黨參、姜黃、枸杞子、郁金、山芋肉等9味中藥組方，長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床。為探討其作用機(jī)制，本研究中通過(guò)四氯化碳致肝纖維化大鼠的影響[3]，探討軟肝寧對(duì)肝纖維化大鼠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

藥物及試劑：四氯化碳（CCl4，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為110524）；秋水仙堿(昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)為20110318）；花生油采用普通食用花生油，試驗(yàn)時(shí)配成20%四氯化碳花生油；軟肝寧(選用黨參、姜黃、枸杞子、郁金、山芋肉等9味中藥組成)按人臨床劑量用體表面積法換算成大鼠用量后，分別研磨配制成實(shí)驗(yàn)濃度，按每10 g體重0．1 mL灌胃，1次／天，用時(shí)搖勻。AST試劑盒（批號(hào)為 20110312）、ALT試劑盒（批號(hào)為 20110426）、HA試劑盒（批號(hào)為 20110409）、LN 試劑盒（批號(hào)為 20110517）、PCⅢ試劑盒（批號(hào)為20110322）、HYP試劑盒（批號(hào)為20110618）及ALB試劑盒（批號(hào)為20110322），均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

動(dòng)物：清潔級(jí) Wister雄性大鼠 60只，體重 210～230 g，由南京江寧縣湯山青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證為SCXK（蘇）2010－2011。

1．2 方法

動(dòng)物分組和造模方法：將60只大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。正常對(duì)照組(A組)給予生理鹽水。模型組(B組)給予20%四氯化碳花生油溶液按每10 g體重0．1 mL皮下注射，首劑加倍，每5天注射1次，首次注射后，用生理鹽水按每10 g體重0．1 mL灌胃，1次／天，連續(xù) 6 周。軟肝寧高、中、低劑量組(C1，C2，C3組)（0．12，0．06，0．03 g／kg）按損傷模型組同法給予CCl4造模，然后給予軟肝寧給藥，1次 ／天，連續(xù)給藥 6周。秋水仙堿組(D組)配成 0．01 g／L按60 kg體重10 mg給藥，1次／天，連續(xù)給藥6周。

標(biāo)本取材及預(yù)處理：各組動(dòng)物在造模或給藥后，以10%水合氯醛麻醉，打開(kāi)腹腔，頸總動(dòng)脈取血 6 mL，3 000 r／min 4℃離心15 min后，分離血清，－20℃保存待檢。取肝臟，切取左側(cè)肝臟組織約5 mm×5 mm×3 mm大小投入10%甲醛固定用作光鏡觀察。

1．3 觀察指標(biāo)

肝纖維化指標(biāo)：用放射免疫法分別測(cè)定血清透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）與肝組織中羥輔氨酸（HYP）的含量，均按試劑盒說(shuō)明書操作。

肝功能：用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）。

常規(guī)病理學(xué)觀察：將大鼠肝組織，用10%的福爾馬林溶液固定，肝組織進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件，各項(xiàng)數(shù)據(jù)采取 X±s表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2．1 肝功能

由表1可見(jiàn)，模型組血清中ALT，AST及MDA的含量較正常對(duì)照組明顯升高（P＜0．01），軟肝寧劑量依賴性降低大鼠血清ALT，AST 水平及 MDA 的含量（P＜0．05或 P＜0．01），可提高血清中SOD含量，軟肝寧組中尤以高劑量組作用更為顯著（P＜0．01）。

表 1 各組 ALT，AST，MDA，SOD檢測(cè)結(jié)果（X ±s，n ＝10）

2．2 肝纖維化指標(biāo)

由表2可見(jiàn)，CCl4肝損傷模型組大鼠血清中肝纖維化各項(xiàng)指標(biāo)及肝組織HYP水平明顯高于正常對(duì)照組（P＜0．01）。與模型組比較，軟肝寧高、中劑量組與秋水仙堿組可顯著降低血清中HA，LN及肝組織 HYP含量（P＜0．05或 P＜0．01），而低劑量組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；軟肝寧高劑量組對(duì)降低LN水平及降低PCⅢ含量?jī)?yōu)于秋水仙堿組（P ＜0．01）。

表 2 各組 HA，HYP，LN，PCⅢ檢測(cè)結(jié)果（X ±s，n ＝10）

2．3 肝組織病理學(xué)結(jié)果

病理切片結(jié)果表明，正常對(duì)照組肝細(xì)胞未見(jiàn)變性與壞死，肝內(nèi)未見(jiàn)纖維組織增生，小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝組織正常。CCl4模型組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)鏡下可見(jiàn)肝組織損害嚴(yán)重，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，有的呈氣球樣變，以環(huán)中央靜脈分布的肝細(xì)胞灶性或片狀壞死，伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。軟肝寧各劑量組均未出現(xiàn)假小葉的形成，相比較而言，中、高劑量組纖維增生較少，局限于匯管區(qū)，低劑量組療效稍差，纖維組織又匯管區(qū)向周圍延伸，變形壞死較嚴(yán)重；秋水仙堿可較好改善肝纖維化損傷。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色(×100倍)

3 討論

肝纖維化指肝內(nèi)細(xì)胞、纖維及基質(zhì)的異常增生，纖維結(jié)締組織增生的病理過(guò)程，是慢性肝病的重要病理階段，也是發(fā)展為肝硬化的物質(zhì)基礎(chǔ)，并且是一可逆階段，其實(shí)質(zhì)是由于膠原和其他細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解失衡，對(duì)此階段的干預(yù)治療處于防止肝纖維化向肝硬化轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵地位[4－5]。

肝纖維化的主要發(fā)生機(jī)理是由于纖維增生和纖維分解不平衡，引起肝臟纖維結(jié)締組織過(guò)度沉積所致[6]。目前，對(duì)于肝纖維化常用的指標(biāo)，仍以病理組織學(xué)檢查和反映膠原代謝的指標(biāo)為主。膠原纖維主要由膠原蛋白構(gòu)成，而羥脯氨酸在膠原蛋白的含量約為14%，所以羥脯氨酸常被認(rèn)為是膠原蛋白的特有成分，因此測(cè)定肝組織羥脯氨酸含量可間接反映肝纖維化的程度。血清中HA，LN，PCⅢ也常用于肝纖維化的診斷，其水平的高低可作為慢性肝組織炎癥壞死、纖維化程度和肝纖維化、肝硬化診斷的重要指標(biāo)[7－8]。因?yàn)镾OD是氧自由基的清除劑，肝細(xì)胞受到自由基攻擊時(shí)，SOD可因其過(guò)度消耗而減少，體內(nèi)SOD活性越高，自由基清除的速度越快。在脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中，MDA是其分解的終產(chǎn)物之一，其含量反映了機(jī)體組織、細(xì)胞損傷的程度[9]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，CCl4誘導(dǎo)的慢性肝纖維化大鼠有明顯的肝損傷及慢性肝纖維化表現(xiàn)。給予軟肝寧治療后，軟肝寧可明顯降低肝纖維化大鼠血清中ALT，AST，MDA水平及提高SOD的含量；高、中劑量還能使升高的 HA，LN，PCⅢ及肝組織中HYP水平顯著降低，且病理觀察提示高劑量軟肝寧可以明顯地抑制模型大鼠肝組織膠原纖維的增生，從而減輕肝細(xì)胞損傷，說(shuō)明軟肝寧對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有良好的防治作用。

近年來(lái)研究證實(shí)，中醫(yī)中藥在治療此病方面體現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)，成為抗纖維化領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于中醫(yī)藥抗肝纖維化的研究，發(fā)現(xiàn)中藥在抗肝纖維化治療中具有明顯的優(yōu)勢(shì)，包括單味藥，復(fù)方的研究[10－11]。軟肝寧是由中藥黨參、姜黃、枸杞子、郁金、山芋肉等9味中藥組成，能延緩四氯化碳造成的大鼠肝纖維化進(jìn)程，能改善肝功能，抗脂質(zhì)過(guò)氧化，并能抑制假小葉的形成及纖維組織的增生。軟肝寧抗肝纖維化作用機(jī)制可能與保護(hù)肝細(xì)胞、抑制膠原合成、降低轉(zhuǎn)氨酶、抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)合成等因素有關(guān)。

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