DNA 修復轉錄因子TFIIH 與毛發硫營養障礙的研究新進展*

★ 熊瑛 雷玲 張吉翔 (南昌大學第二附屬醫院 南昌330006)

DNA 能經歷不同的修飾，包括鏈斷裂、堿基損傷、解旋核以及內源性或外源性鏈交聯(前者由于活性氧化物，后者為紫外線照射)。為維持基因組的完整性及避免基因損害帶來的負面影響，細胞具備一些化學性及遺傳性的DNA 修復途徑。損傷的DNA 如果無法修復，將會為人類帶來一系列的機能紊亂，如發育缺陷、神經畸形、光過敏、癌癥以及加速老化過程。核苷酸剪切修復是最重要的DNA 修復系統之一，它對消除由于抗致瘤藥物以及紫外線照射所引起的某些DNA 損傷起著關鍵作用，比如環丁烷嘧啶(CPD)和嘧啶(6 －4)嘧啶酮產物(它們會破壞DNA 的螺旋結構)。核苷酸剪切修復障礙會導致一些少見的常染色體顯性遺傳疾病，如著色性干皮病、cockayne 綜合癥以及毛發硫營養障礙。11 種基因的突變與這些疾病相關。參與核苷酸剪切修復基因產物，和這11 個基因中的三種(XPB，XPD and p8/TTDA)，是組成轉錄/修復因子TFIIH 的基礎部分［1］。今天，我們將詳細闡述TFIIH 的分子功能及檢測其功能損傷將導致毛發硫營養障礙。

1 毛發硫營養障礙遺傳學特點

遺傳互補實驗揭示了光過敏毛發硫營養障礙患者是由于TFIIH 十個亞基中的三個，即XPD、XPB和p8/TTDA 突變所導致的。甚至在從毛發硫營養障礙患者中提取的細胞中發現，TFIIH 的細胞濃縮物也大大減少了。但是，無論是DNA 修復缺失的程度還是TFIIH 水平下降的程度都與臨床表現型的程度無明顯正相關。著色性干皮病患者的細胞中TFIIH 水平也顯著下降。大部分光過敏毛發硫營養不良病例中，XPD 基因出現變異，其變異位置位于蛋白質末段的C 端或位于R112 環［2］。在這里必須指出，在部分病例中，相同的變異可導致不同的臨床表現型，但是表型的嚴重程度則取決于等位基因的突變特性，這就告訴我們，等位基因可能促成了毛發硫營養障礙的臨床表現型［3］。流行病學研究顯示XPD 中p. H201Y，p. D312N 和p. K751Q 的多態性可能與肺癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌相關，但與類毛發硫營養障礙癥狀無關。在體外實驗中進一步闡述了在體外包含XPD 多態性的TFIIH 復合物中存在正常的DNA 修復和基本轉錄。這個實驗表明XPD 的單一多態性是良性改變，而不同多態性的復合體則有腫瘤化傾向［4］。在XPB 中發現3 個突變，其中只有T119P 突變會導致毛發硫營養障礙。p8/TTDA 是TFIIH 的第10 個亞基，它與光過敏毛發硫營養障礙的第三種類型相關。p8/TTDA 的突變，無論是L21P，R56 終止還是堿基T、C 之間的轉變(在起始密碼子)都將導致p8/TTDA 蛋白缺失［5］。TTDN1 被鑒定為非光過敏毛發硫營養障礙的第一個致病基因。在44 例非光過敏患者中只有6 例出現了基因突變。TTDN1 的堿基切除修復能力正常，其TFIIH 也在保持正常穩定水平［6］。臨床表型的嚴重性與TTDN1 的突變無關，這說明非光過敏毛發硫營養障礙是多因子疾病，除了TTDN1 突變外的其他因素可能影響了該病表型。事實上，TTDN1 與polo－like 激酶1 相互作用通過Cdk1 的磷酸化在調節有絲分裂和胞質分裂中起作用［7］。

2 核苷酸剪切修復中的TFIIH 在毛發硫營養障礙中的作用

核苷酸剪切修復是一個至少需要2 個旁路的多步驟過程。一個是配對轉錄DNA 修復，一個是總體基因組修復，前者只在轉錄活化的DNA 鏈上清除損傷，后者則作用于基因組的任何序列。在真核細胞中，這個過程需要超過30 種蛋白用于可連續作用于損傷DNA 的蛋白:識別DNA 損傷、打開損傷DNA鏈、切開單鏈病清除損傷的DNA 片段、修補并連接DNA 復合物。人類TFIIH 核心部分為一個環形結構，由七個亞基組成:XPB、XPD、p62、p52、p44、p34和p8/TTDA，它與CDK 活化激酶(由Cdk7，cyclin H 以及MAT1 組成)相關。無論這個部位的損傷DNA 修補時通過XPC/HR23B 還是RNA 聚合酶II，TFIIH 都會通過募集XPG 及XPF 內源性核酸酶打開損傷DNA 鏈并加速損傷剪切清除。為使得DNA囊泡化，TFIIH 核心部分啟動2 個具三磷酸水解功能的解螺旋酶蛋白，同時CAK 從核心部分釋放至XPA 與其他核苷酸剪切修復因子附近［8］。雖然CAK 激酶活性通過RNA 聚合酶II 最大亞基的C 端和大量細胞核受體的磷酸化在基本轉錄過程中十分關鍵，但它對核苷酸剪切修復則不是必需的。

2.1 XPB 基因在毛發硫營養障礙中的作用

DNA 在損傷附近打開可能是通過XPB 的解螺旋酶活性驅動。近年來研究表明XPB 的解螺旋酶活性在核苷酸剪切修復中非關鍵因素。但是XPB的三磷酸腺苷酶活性在與XPD 解螺旋酶活性連接是清除DNA 損害所必需的。XPB 除了其7 個解螺旋酶基序中有1 個是三磷酸腺苷連接位點，還占據2 個額外的三磷酸腺苷激酶基序:保守R －E －D 殘余環基序(氨基酸472 －474)和正電荷拇指(ThM)區域(氨基酸514 －537)。這些基序在XPB 的依賴DNA 三磷酸腺苷酶活性調節方面是具備特異性的，有助于TFIIH 與損傷DNA 的連接，并允許其他核苷酸剪切修復因子參與。縱使位于其他解螺旋酶/三磷酸腺苷激酶外的XPB/T119P 變異將擾亂TFIIH結構［9］。TFIIH 的另一個亞基P52 與XPB 相互作用，刺激其ATP 激酶活性。P52 的變異(Dmp52)，降低與XPB 相互作用的穩定性，將導致對紫外線敏感性大大增加、癌變傾向、毛發變脆、角質畸形和發育性缺陷［10］。P52 的突變可能破壞其與XPB 或其他DNA 修復轉錄因子在形態與功能上的相互作用。如果發生在人類的此類突變所致臨床表型，我們稱之為毛發硫營養障礙和著色性干皮病。

2.2 XPD 基因在毛發硫營養障礙中的作用

除XPB 外，TFIIH 包含了另一個DNA 解螺旋酶亞基XPD，它在核苷酸剪切修復過程中打開損傷附近的DNA 有至關重要的作用，而對轉錄起始則作用不大。最近對于XPD 結構研究顯示，其包含了2 個規范解螺旋酶片段(HD1:解螺旋酶基序I，Ia，II，III;HD2:解螺旋酶基序IV，V ，VI)的1 個4 區域機構，鐵硫簇連接和弓形片段。但是，XPD 結構部位的變異與毛發硫營養障礙的臨床表型無關。廣泛分布在4 個片段的毛發硫營養障礙變異可能會干擾不同TFIIH 亞基(這些亞基能影響TFIIH 復合物完整性)的相互作用［11］。盡管著色性干皮病患者的癌癥發生率升高是由于核苷酸剪切修復障礙，但是不知道為何光過敏毛發硫營養障礙沒有惡變傾向。答案可能就來源于免疫細胞化學的研究。在紫外線照射后，在完成大部分損傷DNA 修復后，核苷酸剪切修復因子會立即匯集在損傷位點并在整個細胞核內重新分布。損傷識別蛋白XPC 迅速集中在著色性干皮病和毛發硫營養障礙病患細胞中(在野生型細胞中亦然)。但是在著色性干皮病細胞中，XPC 將會在紫外線照射后24 小時后重新分配并因殘留延遲募集TFIIH 復合物至損傷位點，而在毛發硫營養障礙細胞中，XPC 在3 小時就進行重新分配至損傷位點同時很難募集TFIIH 至DNA 損傷部位［12］。這些結果部分支持了假設:雖然著色性干皮病和毛發硫營養障礙都是由于核苷酸剪切修復缺陷導致，在毛發硫營養障礙中損傷位點核苷酸剪切修復復合物缺失，可能使得合成物反式損傷或復制后修復;而在著色性干皮病中，在不匹配位點出現的核苷酸剪切修復因子殘留可能阻止了復制和/或轉錄過程，將導致基因組不穩定性及癌癥發生率上升。XPB/p52、XPD 與P44 相互作用、TFIIH 的另一個亞基及其聯合都會上調XPD 解螺旋酶活性而不是其三磷酸腺苷酶活性。大部分XPD 變異都位于其C 端并減弱其N 端與P44 的相互作用，這就是為何這些病人會出現核苷酸剪切修復。P44 像典型的泛素連接酶E3(P34 亞基也一樣)具備一個指環片段，而Ssl1p(P44 同源芽酵母)顯示出可影響轉錄的泛素連接酶E3 活性［13］。

2.3 p8/TTDA 在毛發硫營養障礙中的作用

p8/TTDA 是TFIIH 復合物中第10 個且是最小的亞基，其突變只導致毛發硫營養障礙。P52 能上調XPB 活性，p8/TTDA 在體外通過直接與P52 作用從而刺激XPB 的三磷酸腺苷酶活性［5］。XPB、P52和p8/TTDA 這三個亞基的相互聯系作用已被大量遺傳互補實驗所證實。事實上，p8/TTDA 的過表達不僅在TTD － A 細胞、XPD 變異的TTD 細胞以及Dmp52(人類P52 同源體)變異的果蠅屬細胞中都能重建TFIIH 正常水平［14］。這些實驗都強調了P8作為TFIIH 穩定劑的作用，2 個孤立動態的p8/TTDA 池存在:一個與TFIIH 連接而另一個則是往返于胞漿和胞核的備用插入單元。溶液結構實驗顯示后一種形式就像一個同型二聚體。誘導DNA 損傷后，這兩種p8/TTDA 池的平衡被打破，它們迅速替換成為TFIIH 復合物中一個更加穩定形式。結構研究顯示p8/TTDA L21P 突變可能破壞其組成。甚至，R56終止子突變減弱了p8/TTD－A 與p52 的相互作用，最終將導致TFIIH 穩定性下降［15］。還有很多潛在的修飾TFIIH 復合物功能的途徑，因而分析TFIIH各亞基的作用仍需進行大量的研究。分析翻譯修飾后蛋白對大多數細胞周期、TFIIH 所經歷的修飾途徑以及這些修飾途徑如何調節復合物活性具有重大意義，這些對于我們了解毛發硫營養障礙臨床表型的分子基礎有幫助:泛素蛋白酶體下調DNA 修復調節途徑;XPB 與26S 蛋白酶體亞基SUG1 相互作用;MAT1 蛋白化作用調節CAK 活性;其他轉錄后修飾如XPB 磷酸化，通過阻止XPF－ERCC1 核酸內切酶介導的切開步驟，從而調節核苷酸剪切修復［16］。除了上述研究，揭示TFIIH 各亞基功能及修飾作用仍需進一步進行探討。

3 毛發硫營養障礙與轉錄綜合征

DNA 修復缺陷將導致毛發硫營養障礙、著色性干皮病、科凱恩氏綜合征、血液病、沃納綜合癥、Nijmegen 斷裂綜合征、細血管擴張性共濟失調綜合征等等疾病［1］。缺失DNA 修復甚至與神經障礙有關，核苷酸剪切修復活性在終末分化神經元中顯著下降，這說明缺失DNA 修復經典模式下的神經退行性變促成DNA 損傷蓄積直至神經死亡。但是紫外線能深入穿透皮膚真皮而無法進入中樞神經系統，而且毛發硫營養障礙病人相較神經退行性變更受發育性缺陷的痛苦(如髓鞘形成障礙)，說明毛發硫營養障礙臨床表型是由于轉錄缺陷引起。有研究表明核苷酸剪切修復因子與編碼基因的轉錄蛋白相關。在毛發硫營養障礙患者細胞中找到XPD 突變的TFIIH，而著色性干皮病患者則無這一突變，顯示其體外基本轉錄缺失。然而，毛發硫營養障礙和著色性干皮病的成纖維細胞微陣列基因表達分析表明無顯著性差異。毛發硫營養障礙的癥狀主要是由于在分化細胞和特定組織中的轉錄存在明顯差異的發育障礙引起的［17］。最近一項毛發硫營養障礙小鼠模型研究中提出在毛發硫營養障礙發病機制中TFIIH 的輔激活因子相當重要。攜帶了人類患者中的一個突變基因TTD/Xpd (R722W)突變體小鼠出現了相似的臨床表型，如小腦畸形及硫化髓鞘形成，這些缺陷都是由于在中樞神經系統中甲狀腺激素靶基因反常所導致的［18］。事實上，包含R722W 突變的TFIIH無法正確穩定甲狀腺激素受體至其連接位點，導致該受體轉錄缺陷。XPD 其他突變減弱CAK 靶定至TFIIH 核心，其磷酸化PPARs，RARa 和/或VDR 配偶體能力下降，而激素敏感基因的高效表達必須經過磷酸化過程。初期光過敏與核苷酸剪切修復缺失相關，但是其他毛發硫營養障礙患者光敏感癥狀原因則是非常復雜的。除了TFIIH 變異及與之相關核苷酸剪切修復匱乏，近年來研究表明TTDN1 基因與非光過敏毛發硫營養障礙有關，該基因調節細胞有絲分裂及胞質分裂，而無其他機制與毛發硫營養障礙臨床表型相關［19］。從光過敏和非光過敏毛發硫營養障礙細胞的深入研究可能可以提供為毛發硫營養障礙病理生理學研究提供新的線索，并揭開萬能TFIIH 復合物朦朧而美麗的面紗。

［1］Lehmann A R. DNA repair－de?cient diseases，xeroderma pigmentosum［J］. Cockayne syndrome and trichothiodystrophy. Biochimie，2003，85(11):1 101 －1 111.

［2］Botta E. Genotype phenotype relationships in trichothiodystrophy patients with novel splicing mutations in the XPD gene［J］.Hum. Mutat，2009，30(4):438 －445.

［3］Andressoo J O.Rescue of progeria in trichothiodystrophy by homozygous lethal Xpd alleles［J］.PLoS Biol，2006，4，e322.

［4］Laine J P. Common XPD (ERCC2)polymorphisms have no measurable effect on nucleotide excision repair and basal transcription［J］.DNA Repair (Amst)，2007，6(9):1 264 －1 270.

［5］Giglia－Mari G et al. A new，tenth subunit of TFIIH is responsible for the DNA repair syndrome trichothiodystrophy group A［J］. Nat.Genet，2004，36(7):714 －719.

［6］Botta E. Mutations in the C7orf11 (TTDN1)gene in six nonphotosensitive trichothiodystrophy patients:no obvious genotype － phenotype relationships［J］.Hum. Mutat，2007，28(1):92 －96.

［7］Zhang Y. TTDN1 is a Plk1 －interacting protein involved in maintenance of cell cycle integrity［J］. Cell Mol. Life Sci，2007，64(5):632 －640.

［8］Schultz P et al. Molecular structure of human［J］. TFIIH. Cell，2000，102(5):599 －607.

［9］Oksenych V et al.Molecular insights into the recruitment of TFIIH to the sites of DNA damage［J］.EMBO J，2009，in press.

［10］Fregoso M. DNA repair and transcriptional de?ciencies caused by mutations in the Drosophila p52 subunit of TFIIH generate developmental defects and chromosome fragilityMol［J］.Cell Biol，2009，27(20):3 640 －3 650.

［11］Fan L.. XPD helicase structures and activities:insights into the cancer and aging phenotypes from XPD mutations［J］.Cell，2008，133(5):789 －800.

［12］Nishiwaki T .Comparative study of nucleotide excision repair defects between XPD － mutated ?broblasts derived from trichothiodystrophy and xeroderma pigmentosum patients ［J］. DNA Repair(Amst)，2008，7(10):1 990 －1 998.

［13］Burglen，L. The gene encoding p44，a subunit of the transcription factor TFIIH，is involved in large － scale deletions associated with Werdnig－ Hoffmann disease［J］. Am. J. Hum. Genet，1997，60(1):72 －79.

［14］Aguilar－Fuentes J.p8/TTDA overexpression enhances UV－irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model［J］.PLoS Genet，2008，4，e1000253.

［15］Vitorino M.Solution structure and self－association properties of the p8 TFIIH subunit responsible for trichothiodystrophy［J］. J. Mol.Biol，2007，368(2):473 －480.

［16］Kainov D E et al. Structural basis for group A trichothiodystrophy［J］.Nat. Struct. Mol.Biol，2008，15(9):980 －984.

［17］Compe E.Neurological defects in trichothiodystrophy reveal a coactivator function of TFIIH［J］.Nat. Neurosci，2007，10(12):1 414 －1 422.

［18］Compe E . Dysregulation of the peroxisome proliferator － activated receptor target genes by XPD mutations［J］. Mol. Cell Biol，2005，25(14):6 065 －6 076.

［19］Drane P.. Selective regulation of vitamin D receptor － responsive genes by TFIIH［J］.Mol. Cell，2004，16(1):187 －197.