馬鈴薯薯形突變體T-DNA插入側翼序列分析

沈云龍，謝婷婷，柳俊

（華中農業大學生命科學技術學院，華中農業大學園藝植物生物學教育部重點實驗室，國家蔬菜改良中心華中分中心，湖北武漢430070）

遺傳育種

馬鈴薯薯形突變體T-DNA插入側翼序列分析

沈云龍，謝婷婷，柳俊

（華中農業大學生命科學技術學院，華中農業大學園藝植物生物學教育部重點實驗室，國家蔬菜改良中心華中分中心，湖北武漢430070）

以‘鄂馬鈴薯3號’為材料，通過試管薯快速轉基因技術獲得一個編號為pCL2b-2薯形突變系，本研究通過表型鑒定、側翼序列擴增和生物信息學等方法對其進行了研究，目的是分析該突變株表型變化控制機制。結果表明，該突變體的試管薯和溫室收獲塊莖長寬比在p<0.05水平均顯著大于野生型受體薯，其中試管薯長寬比為1.78，野生型試管薯長寬比為1.33；溫室收獲塊莖長寬比為1.50，野生型塊莖為1.29；利用hiTAIL-PCR技術對TDNA插入位點兩側的側翼序列分析表明，T-DNA插入編碼異戊烯基轉移酶（IPT）基因內部，該基因為細胞分裂素合成酶基因（StIPT），暗示StIPT基因可能參與馬鈴薯薯形發育。

馬鈴薯；薯形；異戊烯基轉移酶

馬鈴薯是非谷類作物中最重要的糧食作物，不僅富含淀粉，同時還含有蛋白質、維生素B1、B2和維生素C等，具有全面的營養價值。馬鈴薯耐貧瘠、耐干旱，是許多國家的主食，在解決糧食問題中具有重要作用。全球馬鈴薯年產量保持著穩定的增長，2011年已達到3.74億t，其中中國作為馬鈴薯的第一生產大國，產量達到8 835萬t。

塊莖是馬鈴薯營養生殖和作為蔬菜糧食的重要器官，其發育直接關系到馬鈴薯的營養以及產量。馬鈴薯塊莖形成包括形態學的建成和貯藏物的積累兩個過程。馬鈴薯生長過程中，其地下莖節長出側芽并發育為匍匐莖[1]，在合適的條件下，匍匐莖頂端細胞生長方向改變，經過細胞分裂和細胞膨大過程完成塊莖的形成。馬鈴薯塊莖形成過程中積累了大量的碳水化合物、脂類和蛋白質等物質，其中最顯著的是Patatin和淀粉的積累[2]。植物激素在馬鈴薯塊莖發育中起著重要作用，其中赤霉素（GAs）能促進匍匐莖的形成，但抑制塊莖發育[3]；生長素（IAA）不同濃度處理對馬鈴薯塊莖發育影響不同，其機制尚不明確[4]；細胞分裂素（CK）對馬鈴薯塊莖形成具有雙向調節作用，但其調節機制還不清楚。在馬鈴薯中過量表達擬南芥細胞分裂素氧化酶基因AtCKX2，植株內源細胞分裂素含量降低，該轉基因株系在非誘導結薯條件下也能結薯，在誘導結薯條件下，轉基因株系形成的塊莖大于對照，但單株結薯量降低[5]。

外觀品質是馬鈴薯塊莖品質的重要部分，其中薯形是一些加工性狀的重要品質，如薯片加工要求圓形和橢圓形薯形，薯條加工要求長柱形或者長橢圓形薯形。目前全世界廣泛使用的炸條品種，只有加拿大在80年代初選育的‘Shepody’[6]。由于控制馬鈴薯薯形的遺傳基礎目前并不十分清楚，馬鈴薯薯形育種效率一直很低。

本實驗室用pBI21載體在以E3為受體的農桿菌介導的轉基因過程中，獲得一批T-DNA插入突變株系，其中編號pCL2b-2（未發表）的株系在塊莖表型上與受體E3相比顯著增長，疑是長薯形突變體。本研究對pCL2b-2突變體進行了表型觀察和插入位點側翼序列分析，以期了解薯形變異相關的分子信息，為薯形發育研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

‘鄂馬鈴薯3號’（E3）無菌試管苗為本實驗室保存材料。pCL2b是具有低溫誘導活性的塊莖特異表達融合啟動子，由李萌博士改造。pCL2b-2是以E3為受體，將pCL2b連接到載體pBI121，利用農桿菌介導的轉基因技術獲得的轉基因株系，并由實驗室保存。

1.2 表型鑒定

E3和pCL2b-2試管苗分別在含4%蔗糖濃度的MS培養基，長日照（16 h光照，8 h黑暗）培養3周后，將各植株2～4莖節轉入含8%蔗糖濃度的MS培養基的玻璃試管中，短日照（8 h光照，16 h黑暗）誘導結薯。每個試管苗含一個莖節，11~18個試管苗作為一個重復，共3個重復。將E3與pCL2b-2試管苗在溫室種植，共3個重復，每重復8~10缽，對30 g以上的塊莖用于薯形鑒定。薯形采用長寬比統計。

1.3 RB端載體骨架整合分析

參考成善漢等[7]的方法，在載體pBI121靠近右邊界序列（RB）的T-DNA區設計右邊界反向引物RP-A1，根據右邊界側翼序列設計右邊界正向引物RP-S1和RP-S2等（圖1，各引物間距為500～1 000 bp）。用RP-A1依次與正向引物RP-S1和RP-S2等配對擴增pCL2b-2基因組DNA中插入的T-DNA的RB端側翼序列，分析載體插入片段的大小，各引物序列見表1。

1.4 RB端側翼序列擴增

根據基因組中已知的插入序列設計3個嵌套的特異性引物SP1、SP2和SP3，分別和4組簡并引物組合（表1），以pCL2b-2基因組DNA為模板，利用hiTAIL-PCR技術進行連續的3輪PCR擴增。將引物SP1和4個隨機引物分別組合進行第1輪擴增；將第1輪PCR產物進行40倍稀釋作為第2輪反應的模板，利用SP2和通用引物AC1進行第2輪擴增反應；將第2輪產物10倍稀釋，作為第3輪反應模板，用引物組合SP3和AC1進行第3輪擴增，選擇較大的片段測序。PCR反應體系見表2，PCR反應程序參考Liu和Chen[8]，利用不同的退火溫度選擇性地從突變體中克隆外源插入序列的側翼序列。

圖1 pBI121載體骨架整合分析引物位置Fig 1 Primers for integration analysis on vector pBI121 backbone

表1 hiTAIL-PCR及載體骨架整合分析所用的引物序列Table 1 Primers for hiTAIL-PCR and integration analysis of vector backbone

表2 hiTAIL-PCR反應體系Table 2 Reaction systems used in hiTAIL-PCR

1.5 插入位點分析

根據測序結果，在馬鈴薯基因組數據庫中進行序列比對，查找T-DNA插入位點，并分析插入位點序列信息。對插入位點進行PCR擴增檢測，進一步確定插入位點的詳細信息。

2 結果與分析

2.1 組織培養條件下的表型鑒定

將E3和pCL2b-2在含4%蔗糖的MS培養基中長日照下培養3周后，分別取葉、根和全株進行表型鑒定。結果顯示，組織培養條件下，長日照生長3周的pCL2b-2植株生長正常，與其受體基因型E3在植株表型和長勢上基本一致（圖2）。

圖2 pCL2b-2和E3表型觀察Figure 2 Characteration of pCL2b-2 mutant and E3

圖3 pCL2b-2和E3組織培養條件下表型鑒定Figure 3 Phenotype identification of pCL2b-2 mutant and E3 by culture in vitro

結薯誘導條件下（短日照、8%蔗糖濃度），pCL2b-2和E3均正常結薯。3次重復的試管薯長寬比統計表明，pCL2b-2試管薯長寬比為1.78，比對照E3超出33.92%，統計分析表明，二者差異達到顯著水平（圖3）。

2.2 溫室種植條件下的薯形鑒定

將pCL2b-2和E3同時在溫室種植。正常成熟后，取薯塊大于等于30 g的薯進行統計。結果表明，在溫室種植條件下，pCL2b-2薯形也顯著長于E3，長寬比增長16.88%（圖4）。組織培養和溫室種植條件下表型鑒定結果證明，T-DNA的插入沒有影響突變株的正常生長，但薯形顯著長于受體基因型E3。

圖4 pCL2b-2和E3溫室種植條件下表型鑒定Figure 4 Phenotype identification of pCL2b-2 and E3 by culture in vivo

2.3 側翼序列擴增及插入位點分析

利用引物組合RP-A1和RP-S1對pCL2b-2基因組進行擴增（圖5A），未擴增出條帶，表明T-DNA右邊界（RB）旁側500 bp外無載體序列插入到馬鈴薯基因組中。

在PBI121 RB和NOS-P區設計3個特異性巢式引物SP1、SP2和SP3（表1），采用hiTAIL-PCR方法擴增RB端側翼序列。用SP1分別和隨機引物LAD-1、LAD-2、LAD-3和LAD-4組合（表1），以pCL2b-2基因組DNA為模板進行第1輪擴增。將第1輪的4組擴增產物40倍稀釋作為模板，利用引物組合SP2和AC1進行第2輪擴增（圖5B）。特異性引物與隨機引物LAD-3擴增出來的片段最長，更易擴增出插入片段側翼序列，將該組合第2輪擴增產物10倍稀釋作為模板，利用引物組合SP3和AC1進行第3輪擴增，回收擴增產物，A-T克隆轉化大腸桿菌DH5α，隨機挑選3個克隆測序獲得了965 bp的序列，其中139 bp為T-DNA上RB元件3'端末端6個堿基后的序列（圖6），進一步證明了載體pBI121上RB元件5'端無片段整合到植物基因組中。

圖5 pCL2b-2 RB端骨架整合分析及側翼序列擴增Figure 5 Integration analysis of vector backbone and flanking sequence amplification on pCL2b-2

圖6 RB端側翼序列擴增Figure 6 Flanking sequence amplification of RB

將已擴增的965 bp序列中的826 bp非TDNA序列在馬鈴薯基因組數據庫（PGSC）中進行序列比對，發現該片段與異戊烯基轉移酶（IPT）基因第4個內含子的822 bp片段同源性達到89%。結果表明在pCL2b-2基因組中，T-DNA插入位點是異戊烯基轉移酶（IPT）基因的第4個內含子，該基因在PGSC_DM_v3.4_gene數據庫中的編號為PGSC0003DMG400035440，名稱為StIPT。該基因全長8 607 bp，由6個外顯子和5個內含子組成。

為了進一步確定pCL2b-2的T-DNA是簡單插入到StIPT基因的第4個內含子還是替換掉了該內含子的某一段序列，本研究在T-DNA左邊界序列（LB）前端設計了引物T-DNA LB-1a：5'-ACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCT-3'，在StIPT基因T-DNA插入位點3'端417bp處設計引物T3-S2：5'-GCATCCATTGCTTGAACGGAGGTT-3'，用上述引物對pCL2b-2基因組DNA進行了擴增，得到了606 bp序列（圖7）。

將606 bp片段分別與pBI121和StIPT基因序列比對，結果顯示，擴增片段中103 bp為StIPT第4個內含子部分片段，與RB端擴增的StIPT內含子序列相隔317 bp；剩余的503 bp為T-DNA上LB元件5'端113個堿基前的序列。載體pBI121 T-DNA全長6195 bp，在農桿菌介導的轉基因過程中，T-DNA上RB元件（25 bp）及其邊界6 bp和LB元件（26 bp）及其邊界113 bp未插入到StIPT基因中，而T-DNA上剩余片段替換了StIPT第4個內含子的317 bp片段（圖8）。

圖7 LB端側翼序列擴增Figure 7 Flanking sequence amplification of LB

圖8 StIPT基因T-DNA插入分析Figure 8 Analysis of T-DNA insertion into StIPT

3 討論

IPT基因最初在根癌農桿菌中發現，是細胞分裂素合成的限速酶[9]。在擬南芥中已證實了編碼異戊烯基轉移酶的9個家族成員，分別為ATIPT1-ATIPT9[10]。有研究表明，在馬鈴薯中超量表達農桿菌IPT基因獲得的三個轉基因株系1、11和13，頂端優勢降低，節間多且短，葉片變短，同時根變少[11]。轉基因株系細胞分裂素含量增加，其中一個編號11的株系細胞分裂素含量增加了40%。一些株系在非誘導條件下可發生匍匐莖，在誘導條件下提前結薯[12]。但到目前為止，尚沒有突變馬鈴薯自身IPT基因的相關報道。本研究首次報道插入突變馬鈴薯StIPT基因后，植株薯形發生改變，證實StIPT基因在馬鈴薯植株形態建成中可能發揮重要作用。但該基因突變后，與野生型植株相比，馬鈴薯突變體并未表現出其他形態變化。我們推測，其可能原因是StIPT基因僅在塊莖發育過程中特異表達或該位點突變對StIPT基因表達水平的影響較小。

最近研究顯示，在馬鈴薯中過量表達擬南芥細胞分裂素氧化酶基因AtCKX2，植株內源細胞分裂素含量降低，影響結薯[5]。本研究通過分析StIPT基因突變體植株表型，推測StIPT基因突變后，植株體內細胞分裂合成受到影響。突變體內源細胞分裂素/生長素的比例發生變化，使得馬鈴薯塊莖發育過程中，薯形由圓形發育為長橢圓形。

內含子是基因在轉錄后加工過程中剪切掉的非編碼序列，同時也參與基因的表達調控。內含子5'和3'末端的剪切位點高度保守，其剪切的準確性決定了基因能否正常表達。除去剪切位點，內含子并非無意義的堿基序列。豬肌球蛋白基因MyHC第2個內含子中含有1個75 bp的正調控元件，能通過調控MyHC的轉錄起始來增強該基因的表達；而與該元件偶聯的顯性負調控元件長81 bp，能下調該基因的表達[13]。內含子中能增強基因表達的元件與增強子不同，它對序列的順序和元件所處的位置有很強的依賴性[14]。Salgueiro等[15]發現玉米泛素基因第1個內含子含有類似啟動子的序列，能發揮啟動子的功能。ESRα是豬雌激素受體α基因，其第1個內含子的突變會影響豬的脂肪沉積量和產仔量[16,17]。與此相似，本研究中StIPT基因第4個內含子的317 bp片段可能含有調控該基因表達的功能元件，T-DNA的替換使得StIPT損失了該調控元件，從而改變了StIPT基因的表達水平。

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Flanking Sequence Analysis of a Potato T-DNA Inserted Mutant of Tuber Shape

SHEN Yunlong,XIE Tingting,LIU Jun＊
(College of Life Science and Technology/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology(HAU),Ministry of Education/National Center for Vegetable Improvement(Central China),Huazhong Agricultural University,Wuhan,Hubei 430070,China)

A tuber shape mutant,pCL2b-2,was obtained by T-DNA inserted transformation on microtuber of potato (Solanum tuberosum L.)variety'E-potato 3'(E3).In this study,we identified the tuber shape,amplified the T-DNA flanking sequences and did some bioinformatics work to analyze the tuber shape control mechanism.The length-width ratio of in vitro grown microtubers of the mutant(1.78)was significantly greater than that of the wild type(1.33)(p＜0.05).The shape of tubers grown in pots was also significantly different between pCL2b-2 mutant and the wild type,1.50 vs.1.29.Flanking sequences of inserted location of the T-DNA were amplified by hiTAIL-PCR.Bioinformatics analysis showed thatthe T-DNA was inserted into the isopentenyltransferase(IPT)gene which encodes a cytokinins synthetase StIPT.Itis proposed that StIPT may participate in morphogenesis ofpotato tubers.

potato;tuber shape;isopentenyltransferase(IPT)

S532

A

1672－3635（2013）03-0129-07

2013-04-29

現代農業技術體系體系項目（CARS-10-P08）；國家自然科學基金項目（31000736）；高等學校博士學科點專項科研基金新教師基金課題（20100146120038）。

沈云龍（1988-），男，研究生，研究方向為馬鈴薯生物技術育種。

柳俊，教授，研究方向為馬鈴薯生物技術育種，E-mail:liujun@mail.hzau.edu.cn。