大花萱草擴繁技術研究及管理

田野 李毅

（甘肅農業大學，甘肅 蘭州 730070）

0 前言

1）大花萱草無性繁殖技術研究狀況

（1）大花萱草簡介

大花萱草根分為肉質根和須根，肉質根呈紡錘狀，須根多生長在肉質根上。具短根狀莖，葉翠綠狹長，基生呈帶狀排成兩列?；ㄌ闹胁砍槌觯菪隣罹蹅慊ㄐ颍總€花絮可著花數十朵?；ɡ偎启?，開如漏斗，裂片翻卷，為百合形花冠，花瓣先端裂開。花被基部合生呈筒狀，雄蕊6枚，3長3短，花藥呈丁字形背著在花絲頂端，除藍色和純白色以外其余花色均有栽培品種?；◤阶兓?，花形各異，花期從晚春一直到秋季。大多數品種的花只開一天，但盛花期可以延續幾周甚至幾個月，有些品種單花壽命可超過24小時。蒴果，黑褐色、多棱形、有光澤，自然結實率低，但大部分品種不結實。

大花萱草抗旱能力強，耐高溫，抗低寒，適應溫度范圍廣，在我國從南到北均可種植?？共⌒詮?，對土壤的適應性廣，除過酸、過堿、過沙、過粘的土壤外一般都能栽培，PH值以6.5至7.5之間為好。

該類花卉對堿性土具有特別的耐性，是油田及灘涂地帶不可多得的綠化材料。可用來布置各式花壇、馬路隔離帶、疏林草坡等。亦可利用其矮生特性做地被植物。其中有數個品種為“冬青”型，種植在南國，可四季常綠，是優秀的園林綠地花卉。

（2）繁殖方法

分株分割萱草叢塊是最常用的繁殖方法。該方法操作簡單，植株容易存活，長勢比較一致。分株可將母株叢全部挖出，重新分栽；或者是由母株叢一側挖出一部分植株做種苗，留下的繼續生長。

分株多在春季萌芽前或秋季落葉后進行。春季分株移栽，當年即可抽苔開花；秋季分株移栽，翌年才能抽苔開花。移栽時應選用生長旺盛、花蕾多、品質好、無病蟲害的植株。

分株時挖取株叢的一部分分蘗作為種苗，挖取部分要帶根，從短縮莖處割開，將老根、朽根和病根剪除，盡量保留肉質根，適當剪短（約留10厘米）后即可栽植。栽植應選在晴天進行，邊挖苗，邊分苗，邊栽苗，盡量少傷根，這樣緩苗快。一般2-3年分株一次，以保證植株旺盛的生長勢。

組培用幼嫩葉片、花絲和花苔等器官培養成植株。方法是先誘導幼嫩器官產生愈傷組織，然后用適當培養基在適宜的溫濕光氣等條件下培養成幼小植株。再將小苗假植于營養缽，經一段時間培養成植株幼苗，之后定植。但這種方法還沒有被廣泛接受。

植物的組織培養是利用無性生殖原理，使植物組織在人工控制的條件下，通過細胞的增殖和分化，快速發育成新植株的高新技術手段。近年來，隨著科學技術的迅猛發展，植物組織培養技術已進入生產應用階段。利用這種技術，可以將植物的莖尖、葉片、莖段等切成小片，或用花藥、花粉等在無菌條件下，在玻璃器皿中人工配制的培養基上培養，使它們發育成完整的植物體。利用植物組織培養的方法，只需要用少量植物材料，就可以在短期內誘導出大量“試管苗”。

這種方法不僅繁殖速度快，受季節影響小，而且誘導變異也比較容易，為科研和生產帶來了很大方便。此外，由于植物的生長點細胞分裂速度快，很少感染病毒。因此，采用莖尖培養還可以有效地脫去病毒，從而獲得更加健壯的植株。植物基因工程技術的發展也借助了植物組織培養技術。培養中的植物組織或細胞為外源基因的導入提供了便利；轉基因植物的實驗室篩選和大量繁殖也離不開植物的組織培養。由于植物的組織培養技術科技含量高，繁殖速度快，在農林業生產中已獲得廣泛應用。

2）研究的目的與意義

隨著社會經濟的發展，物質文化生活水平的提高，我國城鄉園林綠化得到了飛速發展，這對美化生活、減少環境污染、改善生態環境起到了很大的促進作用，但是，我們也應該充分認識到目前我國城市綠地建設中已存在不少問題，城市園林植物種類較為單一，城市生物多樣性建設受到影響，特別是地被植物材料嚴重匱乏，導致了草坪面積發展過大、用水量過多、養護費用居高不下等問題，影響了城鄉建設持續性發展。各級政府和組織對植物的種類和品質提出了更高的要求，迫切要求引進能部分代替草坪、抗旱節水、管理費用低和觀賞性強的優質地被植物，以豐富城市園林景觀，豐富生物多樣性，建設更接近自然的生態型城市。宿根花卉-大花萱草因其觀賞期長、觀賞性高、適用性強、種類豐富、群體功能強等優點日益受到人們的重視，因而大花萱草的研究和利用面臨著一個良好的機遇和發展前景。

大花萱草(Hemerocallis hybrida)，為百合科萱草屬多年生宿根草本植物。萱草屬植物全世界共約有15～18個種（中國科學院中國植物志編輯委員會，1980），主要分布于亞洲溫帶至亞熱帶地區，歐洲有少量分布，其中原產我國的就約有11種（北京林業大學園林系花卉教研組，1988），是世界上萱草屬植物種類最多、分布最廣的國家。大花萱草主要用途是觀賞，因其具有既可觀花又可觀葉的雙重價值而廣泛用于切花、盆栽及園林綠化等。萱草花蕾可食用，根可入藥，集觀賞、食用、藥用于一身，是極為可貴的植物資源。

3）植物細胞全能性的表達

早在20世紀初，德國著名植物學家Haberlandt根據細胞學的理論就曾預言，植物細胞具有全能性（Totipotency）。也就是說每個體細胞像胚胎細胞一樣，可以經過體外培養成為一個完整的植株，這是因為植物體的每個細胞都含有該個體的全部遺傳信息，都具有一套完整的基因組，因而具有在適宜條件下可以被誘導分化形成完整植株的潛在能力。直至20世紀50年代末科學家在胡蘿卜組織單細胞懸浮培養中發現某些細胞在形態上轉變為與合子胚相似的結構，其發育過程也與合子胚類似，但由于它是從體細胞分化而來的因而稱之為體細胞胚，并由此形成了再生植株，直到開花結實。這一重大突破不僅證實了植物細胞的全能性，而且為細胞離體培養中研究形態發生機制開拓了一個新的領域。近20余年，植物組織和細胞培養技術得到了迅速發展，大量植物無論是二倍體細胞或單倍體性細胞以及原生質體離體培養均可獲得再生植株。大量事實證明，植物體成熟組織中已高度分化的細胞液保留了回復到分生組織狀態的能力[6]。當然，細胞能夠經歷這一回復過程的程度是不同的，這主要取決于細胞所達到的發育上的、生理上的和細胞上的狀態。

4）形態發生

所謂形態發生就是生物個體發育或再生過程中，機體及其器官形態結構的形成過程。在生物學領域內已經成為一門學科，而且深入到組織和細胞的形態發生問題。它不用于形態學、生理學和胚胎學，而是在應用這些學科知識的基礎上，結合生物化學、生理物理學和遺傳學的知識和技術、專門研究形態發生中有關分化、對稱、極性和相關性等現象的外界條件因子、內在生理化學及遺傳基礎，從而了解其機制，已達到控制目的的一門學科。植物組織或細胞離體培養中的形態發生有器官發生和體細胞胚胎發生這倆種途徑形成再生植株。這兩種形態發生途徑都是以細胞分化為基礎的，它包含了組織和器官的形成。已分化的細胞各自組成了不同的組織，一般形態和技能相同的細胞組成同一種組織，然后再由機能相關的組織形成器官。形態發生的最后結果是形成以個發育成熟的發育植株。

1 材料與方法

1.1 材料:供試大花萱草植株

1.1.1 試劑

乙醇。

吲哚乙酸（IAA）或 2，4-D（生長素類似物）。

氯化汞（升汞）或次氯酸鈉。

6-芐基氨基腺嘌呤（6-BA）

MS培養基

0.1 mol/L NaOH與0.1mol/L HCl

1.1.2 儀器設備

培養室，高壓滅菌鍋，水浴鍋，解剖刀，三角燒瓶（100mL），燒杯，量筒，培養皿，棉線，接種箱或超凈工作臺，分析天平，長鑷子，剪刀，容量瓶，移液管，牛皮紙。

1.2 分株繁殖

分株苗床，寬1-2m，長2-3m，每隔20cm，挖一深約6cm穴。將分蘗苗移植其中，之后覆土，分株苗處理。在萌芽前，將株叢從盆中挖出，去掉傷根、病根，盡量保留肉質根。栽植應選擇晴天進行，邊挖邊分栽，盡量少傷根，一般2-3年分株一次，以保證植株旺盛生長。本實驗以10盆為一組，先設計重復。

1.3 組織培養擴大繁殖

植物組織培養的簡單過程如下:剪接植物器官或組織——經過脫分化（也叫去分化）形成愈傷組織——再經過再分化形成組織或器官——經過培養發育成一顆完整的植株。

植物組織培養的大致過程是:在無菌條件下，將植物器官或組織（如芽、莖尖、根尖或花藥）的一部分切下來，放在適當的人工培養基上進行培養，這些器官或組織就會進行細胞分裂，形成新的組織。不過這種組織沒有發生分化，只是一團薄壁細胞，叫做愈傷組織。再適合的光照、溫度和一定的營養物質與激素等條件下，愈傷組織便開始分化，產生出植物的各種器官和組織，進而發育成一棵完整的植株。

植物組織培養即植物無菌培養技術，是根據植物細胞具有全能性的理論，利用植物體離體的器官如根、莖、葉、莖尖、花、果實等）組織（如形成層、表皮、皮層、髓部細胞、胚乳等）或細胞（如大孢子、小孢子、體細胞等）以及原生質體,在無菌和適宜的人工培養基及光照、溫度等人工條件下，能誘導出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的學科。

1.3.1 配制培養基

配制MS培養基母液和NAA、6-BA等激素母液，比例為大量元素100mL/L，微量元素 10mL/L，有機物 10mL/L，無機鹽 10mL/L，NAA0.01mL/L，6-BA4mg/L，瓊脂 7.5mg/L，蔗糖 30mg/L，調 pH 值 5.6～5.8，放在三角瓶中，每瓶大致40mL，高壓滅菌鍋中滅菌，備用。

表1 配置MS培養基所需試驗材料及配置方法

培養基分類:

（1）愈傷組織誘導培養基:MS培養基（蔗糖含量為 10g/L，2，4-D含量為 2mg/L，瓊脂10g/L）。

（2）試驗培養基:在 MS培養基中加入 IAA和 6-BA。

吲哚乙酸（IAA)先用少量0.1 mol/L NaOH溶解，6-芐基氨基腺嘌呤先用少量0.1 mol/L HCl溶解，然后用蒸餾水稀釋，再加入培養基中。

1.3.2 取材與消毒

取實驗材料，用流水沖洗4-5次，用刀將莖外部切掉，并將莖切成小段，取每一段上帶有1-2個芽點植株為外植體，再用蒸餾水沖洗，然后放到超凈工作臺上表面滅菌，流程為70%酒精20s-50mLNaF10min——無菌水沖洗3-5次，然后接種。

1.3.3 接種培養

將消毒過的萱草外植體在消過毒的濾紙上切成0.5cm大小方塊，接種到培養基上，每瓶接種三個，接種過程中，所用器具應用75%酒精棉擦拭，酒精燈火焰上消毒。避免工具帶菌，造成交叉感染，接種后將培養瓶移入培養箱上培養，溫度控制在22度左右，每天光照12-16h，光照強度1000-2000lx，一般培養1-7d后，莖段邊緣突起分化成芽。待10d后，繼代培養。

1.3.4 初代培養

初代培養旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某些外植體后，最初的幾代培養。初代培養時，常用誘導或分化培養基，即培養基中含有較多的細胞分裂素和少量的生長素。初代培養建立的無性繁殖系包括:莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。

采用外源的細胞分裂素，可促進使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側芽啟動生長，從而形成一個微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結構。在幾個月內可以將這種叢生苗的一個枝條轉接繼代，重復芽苗增殖的培養，并且迅速獲得多數的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉移到生根培養基上，就能得到可種植到土壤中去的完整小植株。

在培養中由外植體產生不定芽，通常首先要經脫分化過程，形成愈傷組織的細胞。然后，經再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構成器官的縱軸上表現出單向的極性（這與胚狀體不同）。多數情況下它形成芽，后形成根。

1.3.5 繼代培養

在超凈工作臺上，將初代培養的芽叢分割，同時用解剖刀將植株底部褐化部分、新葉切除，以減少由于葉片生長而引起營養物質消耗，對芽分化的抑制從而促進芽的分化，達到實驗目的同時統計每瓶中外植體分化芽的數目。實驗以10瓶為一組，共計10個重復。

2 結果與分析

2.1 分株發芽率和組織培養繁殖率

2.1.1 每一母株分化芽數量統計表

表2

2.1.2 組織培養數量統計表

表3

2.1.3 分株發芽率和組織培養繁殖率比較

分株繁殖一輪發芽率75.3%，繁殖率較高，組培三周左右繁殖率達5.33%。比較得知，組培較分株繁殖率高，而且時間短，可達到短期繁殖目的。

2.2 各因素對大花萱草擴繁的影響

在本實驗中，曾出現污染現象，原因可能是:

2.2.1 實驗儀器消毒未凈

2.2.2 解剖刀鈍，殺死組織或引起葉片卷曲

2.2.3 葉片生長接觸三角瓶蓋，引起植株感染

2.2.4 對外植體消毒時，未將組織病毒全部殺死

2.2.5 每次操作后對儀器滅菌不干凈引起交叉感染

圖1 組織培養Figure 1 Tissue culture

3 討論

通過分析，規范操作技術，最終達到無污染，快速繁殖的結果，形成一整套快繁技術。

在結果中，認為分株和組培均可達到繁殖要求，但組培要求過高，實驗儀器精密，需要專業人員操作，而且耗費太大。對于一些稀有品種或結實率不高的品種，可以采用組培達到目的，以保存物種；對于普通品種，分株即可達到擴繁目的。

通過實驗，了解并掌握了如何快速準確的查找資料，提高了分析問題，解決問題的能力。經過對最初實驗失敗原因總結，對實驗條件，實驗過程有了全面的認識，為以后實驗的順利進行打下良好的基礎。但由于掌握的知識有限，雖在實驗的過程中不斷發掘明確實驗目的和方法，但試驗仍有一些不足之處，希望在今后的實驗中完善。

本實驗中大花萱草培養的器官分化途徑有三種情況:一是，在愈傷組織表面形成芽；二是，在愈傷組織內部形成根；三是，在同一塊愈傷組織的內外分別形成根和芽。一般來說，先形成芽的經再培養較易形成根，種植容易成活；而先產生根的在培養45d后仍未見形成芽，至于繼續培養下去能否在其上方分化出芽，還需要做進一步深索。

4 結語

通過組培可使大花萱草得到擴繁，快繁無病毒不變異苗木。在實驗過程中一定要注意充分消毒，防止感染。組培中容易發生褐化、玻璃化現象。在操作時盡量采用不易變異的外植體擴繁，以縮短繼代時間。限制繼代次數。每隔一定繼代次數后重新開始。切取外植體材料時，采取適當的生長調節物質種類和較低濃度，或少或不使用培養基中易引起變異的化學物質。定期配制，及時處理，跟蹤檢測，最終形成一套擴繁方法，指導大花萱草在北方地區引種生產及應用，從而使其在園林中更有用。

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