我國梨腐爛病病原菌的初步鑒定及序列分析

周玉霞　程櫟菁　張美鑫　翟立峰　洪霓　王國平　王利平

摘 要：【目的】為了對我國梨腐爛病病原菌進行初步鑒定和序列分析，【方法】從我國15個省（市）梨產區采集腐爛病樣品并觀察其田間危害癥狀，通過組織分離法分離獲得168份梨腐爛病菌分離株，從中選取72份進行單孢純化，共獲得79份梨腐爛病菌純化分離株；觀察在PDA、25 ℃黑暗條件下病原菌菌落形態以及產孢體形態，并對其在梨枝條上產生的分生孢子器徒手切片置顯微鏡下觀察其結構特征和分生孢子形態；采用菌絲塊接種法測定梨腐爛病菌在‘翠冠梨離體枝條上的致病力。對部分菌株rDNA-ITS進行PCR擴增、測序，利用BLAST軟件與GenBank數據庫進行序列相似性分析，并用MEGA 4.1和鄰接法構建系統發育樹。【結果】根據梨腐爛病菌各分離株在PDA上的菌落形態特征可分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種菌落類型，不同梨腐爛病菌分離株在PDA上產生多種類型的產孢體，不同梨腐爛病菌菌株在離體梨樹枝條上的致病力存在差異，我國梨腐爛病菌的rDNA-ITS核苷酸序列一致率為99.98%～100%，與蘋果腐爛病菌分別聚在同一亞組的兩個分支。【結論】我國梨腐爛病病原菌存在不同的菌落類型，其rDNA-ITS核苷酸序列分析顯示均為V. mali var. pyri。

關鍵詞： 梨腐爛病； 蘋果腐爛病； rDNA-ITS； 致病力

中圖分類號：S661.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0140-07

梨腐爛病（Valsa canker of pear）又名爛皮病，主要危害梨樹的主枝和側枝，導致梨樹勢衰弱，果實產量和品質下降。該病具有發生區域廣、發病率高、難以控制的特點。在我國梨主產區均有發生，尤以新疆、西北、華北、東北等地發生嚴重[1]。發病嚴重的梨園，樹體病疤累累、枝干殘缺不全，造成大量死樹或毀園。目前國內外對梨腐爛病病原菌種類及其歸屬尚未十分明確，起初，我國學者根據病原菌的形態學特征鑒定為梨黑腐皮殼菌[Valsa ambiens （Pers.） Fr.][2-3]，后來通過比較其與蘋果腐爛病菌形態學性狀以及酯酶同工酶譜和致病性方面的異同，認為梨腐爛病菌是蘋果黑腐皮殼梨變種（Valsa mali var. pyri）[4]。日本學者Kobavashi[5]認為V. mali與V. ceratosperma是同一種菌的兩個異名。在很長的一段時間內，V. mali和V. ceratosperma 均被用作梨和蘋果腐爛病菌的名稱[6-9]，之后更多采用V. ceratosperma。王旭麗等[10]通過對病菌的ITS序列測定分析并結合培養特征鑒定認為，梨腐爛病菌和蘋果腐爛病菌可統稱為V. ceratosperma。WANG等[11]認為V. mali是引起我國梨腐爛病和蘋果腐爛病的主要病原菌，V. mali中又分為兩個變種，梨腐爛病菌為V. mali var. pyri，它既可以引起梨腐爛病也可以引起蘋果腐爛病；蘋果腐爛病菌為V. mali var. mali，它則主要是引起蘋果腐爛病。此外蘋果腐爛病的病原除了V. mali外，還發現少部分為V. malicola。

研究通過對我國梨產區梨腐爛病的調查、采集、分離獲得梨腐爛病菌分離株，對其進行生物學特性的觀察、致病力的鑒定、測定并分析其rDNA-ITS基因序列，分析我國梨腐爛病病原菌分離株的生物學特性與其基因組rDNA-ITS基因序列是否存在相關性，我國梨腐爛病菌不同分離株致病力的差異與寄主種類及地理來源之間是否存在相關性，旨在明確我國梨腐爛病病原菌的種類組成。

1 材料和方法

1.1 材料

2010年5月至2012年5月，依托于國家梨產業技術體系21個綜合試驗站，根據梨樹腐爛病在田間的病害癥狀特征，在我國15個省市（黑龍江、遼寧、吉林、新疆、河北、北京、山西、陜西、甘肅、山東、河南、湖北、安徽、福建、云南）的梨產區采集梨腐爛病病樣，共分離獲得168份梨腐爛病菌株（表1）。另從山西蘋果樹腐爛病病樣上共分離獲得7份蘋果腐爛病菌株作為參照菌株。

1.2 方法

1.2.1 病原菌株的分離、純化 采用常規組織分離法[12]，從病斑邊緣病健交界處取樣分離、培養獲得梨腐爛病菌分離株。選取不同省份部分分離株在25 ℃、黑暗條件下于PDA平板上進行培養至產生分生孢子角，挑取分生孢子角制備孢子懸浮液涂于PDA平板上培養，孢子膨大后挑取單孢置于新的PDA平板上培養獲得純化菌株[13]，將純化菌株保存于PDA斜面試管中，于4 ℃貯存備用。所有病樣及菌種保存于華中農業大學果樹脫毒種質資源室內保存中心。

1.2.2 病原菌株形態觀察 將接種不同純化分離株的PDA平板置于25 ℃、黑暗條件進行培養， 觀察菌落的顏色、形狀、氣生菌絲的疏密程度和產孢體的形態特征，記錄產孢體的大小及分布情況。將病菌在PDA平板上培養至產生分生孢子角，挑取分生孢子角制備孢子懸浮液涂于PDA平板上于25 ℃、黑暗條件下培養，觀察孢子萌發特征。

選取梨1 a生離體枝條，將梨腐爛病菌接種枝條上（用直徑為5 mm的打孔器在梨枝條上打孔，將用同樣大小打孔器打孔獲得的菌絲塊接種其上，保鮮膜覆蓋保濕），待發病3周后，發病枝條上產生黑色小點，挑取黑點制作徒手切片，置光學顯微鏡（NIKON JAPAN）下觀察其形態特征并拍照、記錄。

1.2.3 致病性測定方法 將‘翠冠梨離體1 a生枝條用清水洗凈晾干，再用酒精消毒并晾干，將其剪成約15 cm長的小段，兩端用石蠟封口。用直徑為5mm的打孔器在小段枝條的中央打孔，從各分離株在PDA平板上生長2 d時的菌落邊緣打取大小一致的菌絲塊進行接種，同時用接種空白PDA培養基的枝條作為對照，然后附上滅菌濕棉花并將其置于用酒精消過毒且鋪有滅菌濕紗布的白色塑料盤中，用保鮮膜封口，將其置于25 ℃、光暗交替（12 h/12 h）環境下，每份菌株4次重復。培養至2 d，將棉花和菌絲塊去掉并觀察其發病情況，培養至4d，調查、記錄枝條發病狀況，測定病斑長度。數據分析采用SPSS軟件分析，處理間的差異顯著性采用Duncans Multiple Range Test。

1.2.4 DNA的提取 將菌株轉入鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板中央培養，3 d后收集菌絲，液氮研磨，采用CTAB法[14]提取其基因組DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA的質量并估計其濃度。

1.2.5 rDNA-ITS基因的擴增、克隆及測序 以梨腐爛病菌分離株基因組DNA為模板進行rDNA-ITS基因的PCR擴增。采用引物為真菌基因組轉錄間隔區通用引物ITS1和ITS4[15]，ITS1：5-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3；ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3。rDNA-ITS區域PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；進入循環94 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。

純化的PCR產物連接到PMD18-T載體（TaKaRa），轉化到E.coli 菌株DH5α感受態細胞，涂布于含Amp的LB平板上，37 ℃培養過夜，挑選單菌落， PCR擴增鑒定陽性克隆，由南京金斯瑞生物技術有限責任公司自動測序儀進行測序。在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）BLAST中搜索黑腐皮殼屬及相近屬真菌的分離物，與本研究測定的腐爛病菌分離株的ITS基因區域序列進行比較分析。采用DNAMAN、Clustalx W（1.83）（http：//clustalw.genome.jp） 軟件對其核苷酸序列進行多重比對和分析，遺傳進化分析軟件MEGA 4.1，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹， 重復1 000次[16]。

2 結果與分析

2.1 田間腐爛病癥狀觀察結果

梨腐爛病危害梨樹主干、主枝、側枝及小枝的樹皮，致使樹皮表現腐爛癥狀。病皮外觀初期紅褐色，水漬狀，稍隆起，用手按壓有松軟感，多呈橢圓形或不規則形，常滲出紅褐色汁液，有酒糟氣味。用刀削掉病皮表層，可見病皮內呈黃褐色，濕潤、松軟、糟爛（圖版-A1）。發病后期，表面密生小粒點為梨腐爛病病原菌的分生孢子器，刮開病斑表皮可見分生孢子器暗褐色、錐形、埋生（圖版-B1），分生孢子器多腔室，形狀不規則，器壁暗褐色，有一共同孔口，孔口處黑色，通到表皮外（圖版-C1）。雨后或空氣濕度大時，從分生孢子器中可涌出病菌淡黃色的分生孢子角（圖版-D1）。

2.2 梨腐爛病菌形態特征觀察結果

選取來源于不同地區的72份梨腐爛病菌分離株進行單孢分離、純化培養共獲得79份菌株。將其在PDA平板25 ℃、黑暗條件下培養至5 d進行菌落形態觀察，可將梨腐爛病菌分為2種不同的菌落類型，分別稱為Ⅰ型和Ⅱ型；其中Ⅰ型菌落類型72份，Ⅱ型菌落類型7份。Ⅰ型菌落在PDA上培養至5 d時表現為菌落羽狀、乳白色、質地柔韌、結構致密，并具有乳白色的氣生菌絲，在菌絲的生長過程中分泌膠狀物質使菌絲緊貼培養基生長（圖版-A2）；5 d后培養至20 d，菌株的培養基顏色均為乳白色。Ⅱ型菌落在PDA上培養至5 d時表現為菌落羽狀，菌絲乳白色，質地柔韌、結構致密，分泌膠狀物質和色素，色素使培養基呈現黃綠色（圖版-B2）；Ⅱ型菌株培養至20 d時，分泌的色素使PDA培養基顯現出淺黃色、橙黃色、灰色、黃褐色的變化。

對梨腐爛病菌菌株在PDA上培養產生的產孢體形態及分布情況進行了觀察記錄，結果表明梨腐爛病菌在PDA上培養至40 d時，菌株出現菌絲團或不同類型的產孢體，分別稱為A、B、C、D、E、F、G和H型（圖版-A3， B3， C3， D3， E3， F3， G3， H3）。A型為菌株產生菌絲團；B型產孢體大小在0.8～2.8 mm之間，外圍分布的產孢體密集且大小均有，分布于培養皿中心的產孢體大而疏散；C型產孢體大小在0.1～0.2 mm之間，在整個皿中均勻密集分布；D型產孢體大小在0.1～2mm之間，稀疏分散分布；E型產孢體大小在0.1～4mm之間，大多數產孢體集中在3.5 mm左右，稀疏均勻分布；F型產孢體大小在0.1～1.5 mm，小產孢體均勻密集分布，大產孢體均勻稀疏分布；G型產孢體大小在0.5～2.2 mm，它們集中在2 mm左右，呈中央密集，邊緣稀疏分布；H型產孢體大小在0.2～0.8 mm，稀疏分散分布。B、E、F、G

型產孢體均在培養基上形成，前期分泌灰綠色透明的黏狀物，后期孔口處被菌絲包住呈半包埋狀，有多個孔口，形成白色球狀的產孢體。C、D型產孢體均在培養基表面形成，先形成小的菌絲團，后期逐漸露出黑色小點。H型產孢體成黑色的小點，一般是2～3個小點聚在一起。

對梨腐爛病菌在PDA培養基上分子孢子動態變化進行了觀察，結果表明分生孢子香蕉形，大小為 3.5～8 μm×0.65～1.2 μm。分生孢子萌發時先膨大，至12 h左右時，有些分生孢子可膨大至原孢子大小的數倍，成球形或近似球形，至48 h左右膨大的孢子向外伸出芽管，伸出芽管的數目為1～4根。對梨腐爛病菌接種在梨樹枝條上產生的黑點進行了徒手切片顯微觀察，結果顯示腐爛病菌的分生孢子器具有多個腔室，共用一個孔口，集于分生孢子器中央，腔壁內部凹陷，形成多個小室。

2.3 來源于我國不同梨產區的梨腐爛病菌rDNA-ITS基因核苷酸序列分析

選取我國不同梨產區的38份梨腐爛病菌分離株和7份蘋果腐爛病菌分離株進行rDNA-ITS基因的PCR擴增，電泳檢測結果表明：38份梨腐爛病菌分離株和7份蘋果腐爛病菌分離株的rDNA-ITS序列擴增均得到大小約為544 bp的特異性片段，與預期目標片段大小一致，而陰性對照無任何條帶。

將來源于我國12個省（市）（黑龍江、云南、安徽、河北、遼寧、新疆、甘肅、北京、山西、山東、河南、福建）梨產區的38份梨腐爛病菌株以及來源于山西、山東的7份蘋果腐爛病菌株，并選取有代表性的在GenBank上登錄的來源于不同國家地區、不同寄主的腐爛病菌株基因核苷酸序列進行系統進化樹分析，結果表明：來自我國的38份梨腐爛病菌株其rDNA-ITS核苷酸序列一致率為99.98%～100%，與來源于意大利的梨樹腐爛病菌（GenBank， Acc.No.， DQ241769）聚為同一分支為V. mali var. pyri[11]（圖1）；來自山東煙臺、山西運城蘋果樹上的7份蘋果腐爛病菌的rDNA-ITS核苷酸序列一致率為100%，并與來源于日本的蘋果樹腐爛病菌株（GenBank， Acc.No.， AF192326）聚為另一分支V. mali var. mali[11]（圖1）。這2個分組之間的菌株有7個堿基的差異，但它們同屬于V. mali組。來自不同國家和地區（日本、烏干達、美國、南非）以及不同寄主（桉樹、橡樹、桃）來源的腐爛病菌株與來自我國梨樹和蘋果樹寄主上的腐爛病菌分別聚為不同的亞組，其中來自不同地區的桉樹寄主上的腐爛病菌聚為同一亞組，來自不同地區桃樹寄主上的腐爛病菌聚為同一分支，來自橡樹寄主上的腐爛病菌自成一個獨立分支，而我國的梨樹和蘋果樹寄主上的腐爛病菌聚為同一個亞組，表明腐爛病菌菌株與地域、寄主種類間存在一定的相關性。

2.4 梨和蘋果腐爛病菌致病性測定結果

將梨和蘋果腐爛病菌接種‘翠冠梨離體枝條，接種1 d后均開始發病，4 d時梨腐爛病菌在枝條上形成潰瘍狀病斑，病斑中間呈紅褐色，邊緣黑褐色，組織軟化；蘋果腐爛病菌在枝條上形成黑褐色潰瘍斑，病斑處表皮均因為失水而皺縮（圖版-A4， B4， C4， D4， E4， F4， G4）。采用SPSS軟件對梨腐爛病菌菌株接種至4d的病斑長度進行顯著性差異分析將我國梨腐爛病菌菌株致病力分為3個等級，病斑長度命名為LD，LD≧4.10 cm為強致病力菌株，4.10 cm﹥LD﹥2.50 cm為中等致病力菌株，LD≦2.50 cm為弱致病力菌株。按照劃分標準，本研究獲得強致病力菌株18份，中等致病力菌株50份，弱致病力菌株9份。來源于不同省份的Ⅰ型和Ⅱ型菌落類型的梨腐爛病菌株在致病力上均存在強、中、弱的差異。蘋果腐爛病菌株的致病力在梨樹離體枝條上比梨腐爛病菌株弱（圖2）。

3 討 論

本研究從我國15個省（市）的梨產區采集分離培養共獲得168份梨腐爛病菌菌株，對來源于不同地區的72份菌株進行單孢分離、純化，共獲得79份梨腐爛病菌分離株。梨腐爛病菌分離株在PDA上培養的菌落形態表現為2種菌落類型，分別為Ⅰ型和Ⅱ型，均與作為參照菌株的蘋果腐爛病菌在PDA上培養的菌落形態不同。對梨腐爛病菌的產孢體形態特征的觀察結果表明，我國梨腐爛病菌分離株的產孢體類型存在多樣性。來源于不同地區的梨腐爛病菌株以及作為參照菌株的蘋果腐爛病菌株分別在‘翠冠離體梨樹枝條上接種測定致病性的結果表明，梨腐爛病菌菌株產生的病斑與蘋果腐爛病菌分離株明顯不同，其致病力存在差異，梨腐爛病菌的致病力強于蘋果腐爛病菌。本實驗室還對這兩種病菌在蘋果枝條上接種測定了致病力，結果顯示，蘋果腐爛病菌的致病力強于梨腐爛病菌株。這些結果暗示，梨腐爛病菌致病力的強弱可能與寄主種類有一定的相關性。梨腐爛病菌在‘翠冠梨離體枝條上的致病力測定結果顯示，來源于我國不同梨產區的梨腐爛病菌致病力的差異與其地域來源及菌落類型均無明顯的相關性。深入了解我國梨腐爛病菌致病力的分化特征，還需用不同梨系統品種材料做進一步研究。

基于梨腐爛病菌分離株生物學形態特征的多樣性，本研究對來源于我國梨產區腐爛病菌菌株的rDNA-ITS基因序列進行分析，結果顯示來源于我國的梨腐爛病菌分離株在ITS基因進化樹中聚集為獨立分支，表明我國梨腐爛病菌分離株組成比較單一，均為V. mali var. pyri[11]，與蘋果腐爛病菌分離株聚集為同一亞組的2個不同分支。據報道，蘋果腐爛病菌分離株組成除了V. mali，還發現有V. malicola[11]，我國梨腐爛病菌分離株組成除了V. mali var. pyri，是否還存在其他病原菌，以及I型和II型梨腐爛病菌在其基因轉錄和表達水平上是否有差異，目前正在深入研究之中。

綜上所述，本研究對來源于我國梨主產區的腐爛病菌分離株進行了田間癥狀特征觀察、在PDA上的培養形態觀察、rDNA-ITS基因序列分析以及離體梨樹枝條致病力測定，初步鑒定并分析了我國梨腐爛病菌分離株病原菌種類組成，該研究結果為深入研究我國梨腐爛病發生流行規律以及防治策略的制定奠定了一定的基礎。

4 結 論

通過對79份純化菌株培養特性的觀察，發現我國梨腐爛病菌存在Ⅰ型和Ⅱ型2種菌落類型，2者的致病力沒有明顯的差異；基于rDNA-ITS基因核苷酸序列的分析結果，我國梨腐爛病菌的分離株聚為一組，均屬于V. mali var. pyri。（本文圖版見封底）

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