柑橘采后腐爛主要致病菌的分離鑒定及丁香精油對其抑制作用研究

解淑慧　邵興鋒　王可　張興龍　王鴻飛

摘 要：【目的】為了確定浙江寧海本地柑橘優勢腐敗菌及丁香精油對其的抑菌效果，【方法】從自然腐爛的柑橘上分離優勢菌，采用傳統真菌形態學鑒定方法結合rDNA-ITS序列分析方法進行鑒定，并采用體外試驗研究丁香精油對優勢菌的抑菌效果。【結果】結果表明，浙江寧海本地柑橘分離所得6株真菌分別為指狀青霉（Penicillium digitatum）、柑橘鏈格孢（Alternaria citri）、枝孢樣枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）、 聚多曲霉〔Aspergillus sydowii）、近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）和卡利比克畢赤酵母（Pichia caribbica）；其中P. digitatum和C. cladosporioides是優勢腐敗菌；體外抑菌試驗表明，丁香精油對P. digitatum和C. cladosporioides有較好的抑菌效果，抑制中濃度（EC50）分別為2.51 mL·L-1和0.57 mL·L-1；最小抑菌濃度（MIC）分別為6 mL·L-1和3 mL·L-1。【結論】丁香精油可以抑制柑橘采后主要病原菌的生長。

關鍵詞： 柑橘； 優勢菌； 分離鑒定； rDNA-ITS； 丁香精油

中圖分類號：S666 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0134-06

浙江是全國柑橘的主要產地之一，但是在柑橘采后貯藏過程中，真菌引起的病害造成約10%的損失或者更高，帶來了巨大的經濟損失。國內外學者認為，指狀青霉（Penicillium digitatum）和意大利青霉（Penicillium italicum）是引起柑橘采后腐爛的主要真菌[1]。對柑橘等果實采后主要致病菌的分離鑒定，是選擇采后防腐保鮮方法的前提。

目前對真菌的鑒定主要采用傳統形態學方法，該方法由于經驗、時間等限制，在實踐中有一定的困難。近年隨著分子生物學的發展，分子手段被廣泛地應用于真菌的分類鑒定，特別是rDNA- ITS 分子標記法。真菌rDNA的引物ITS1和ITS4適用于大多數擔子菌和子囊菌的檢測。而由于真菌核酸序列的rDNA在18s、28s區域具有保守性，在ITS區段又存在在屬、種水平上的差異[2]。因此通過對ITS區進行擴增測序，來檢測病原真菌的技術已越來越被廣泛應用[3]。

丁香為桃金娘科植物丁香（Eugenia Cargophyllata Thunb） 的干燥花蕾，是我國的傳統中藥。丁香精油含有丁香酚、乙酰丁香酚、丁香烯等成分，對葡萄灰霉菌、鏈格孢、桔青霉等多種病原菌具有較強的抑制作用[4-7]。有研究表明丁香精油對蘋果的采后貯藏有明顯的保鮮效果[8]， 但丁香精油在柑橘防腐保鮮上的研究鮮見報道。

我們擬從浙江寧海本地產柑橘上分離優勢菌，采用傳統真菌形態學分類鑒定結合rDNA- ITS 分子標記法對所分離到的菌株進行鑒定，以確定地產柑橘的優勢腐敗菌；同時，進一步分析丁香精油對柑橘主要優勢腐敗菌的抑制效果，以期望將丁香精油這一綠色防腐保鮮方法應用于柑橘采后病害的防治。

1 材料和方法

1.1 材料

柑橘品種為早熟宮川，選擇浙江寧海柑橘果園樹上自然發病和采后貯藏過程中自然腐爛的果實。丁香精油純度95%以上，購自成都科帝亞試劑有限公司。

1.2 柑橘采后優勢菌的分離

從自然發病的柑橘果實病健處切取果皮組織，用75%的醫用酒精消毒1 min，無菌水沖洗下孢子接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA），25 ℃培養[9]。經多次劃線分離得純種菌株。

1.3 菌株致病性檢測

將純化培養的菌株用無菌水配制成菌懸液，調至105個·mL-1。將柑橘果實用2%次氯酸鈉溶液消毒2 min，清水洗凈，用消毒接種針在柑橘果實赤道處刺一個直徑3 mm、深3 mm的傷口，在傷口處分別接種20 μL孢子懸浮液，晾干，于25 ℃培養觀察果實發病情況。根據柯赫氏法則，檢測菌株的致病性。

1.4 菌株傳統形態學觀察

將培養7 d的菌落，挑取邊緣菌絲放在滴有乳酸石炭酸棉藍染色液的載玻片上，置于顯微鏡下觀察[10]。

1.5 菌株rDNA-ITS 序列分析

1.5.1 DNA的提取 將純化所得的6株菌接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB），25 ℃、140 r·min-1培養3 d后，6000 r·min-1離心10 min，取少量菌絲，用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒（上海生工生物有限公司）提取DNA，按說明書操作。

1.5.2 基因序列的測定 采用通用引物 ITS1 （5- TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3） 與 ITS4 （5- TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3） 進行PCR擴增。PCR反應體系：dNTP 4 μL，10×PCR buffer 5 μL（含15 mmol·L-1鎂離子），引物各1 μL，Taq酶 0.5 μL，模板DNA1 μL，用dd H2O補至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s， 54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個循環，72 ℃終延伸10 min。將PCR擴增產物直接送往上海生工生物有限公司進行DNA測序。

1.5.3 同源性分析 將測序結果進行BLAST比對，利用MEGA軟件對測序所得序列及GeneBank中選取的參比菌株的18S rDNA基因序列進行同源性分析，構建系統發育樹[11-12]。

1.6 丁香精油對P. digitatum和C. cladosporioides的抑菌效果

根據致病性檢測結果選取P. digitatum和C. cladosporioides 2株菌進行丁香精油抑菌效果的研究。用含1%（v/v）吐溫-80的無菌水將丁香精油分別稀釋為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0 mL·L-1。參考楊紅等[13]的方法，無菌條件下，向培養皿里倒入9 mL 50 ℃左右的PDA培養基，加入1 mL不同濃度的精油溶液，混勻，制得含丁香精油平板。待培養基凝固后，用直徑5 mm的無菌打孔器在生長3 d的菌落邊緣切取菌餅，接種至含丁香精油PDA培養基中心，于25 ℃恒溫培養5 d，以不含丁香精油培養基生長的菌落作對照，測量空白組和處理組菌絲直徑，計算丁香精油對P. digitatum和C. cladosporioides菌絲生長的抑制百分率，以生長過程中無菌絲生長的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。每種處理5個平行，重復3次，取其平均值。

根據不同配比的抑制率，將抑制率換算成幾率值（y），藥劑體積分數（mL·L-1）換成對數值（x），建立毒力回歸方程（y=b+ax），計算出對病原菌的抑制中濃度（ EC50） 。

菌絲抑制率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌餅直徑）×100。

1.7 數據分析

采用EXCEL 2003軟件進行數據統計，所有數據均為3次重復實驗的平均值。并利用MEGA 4.1對基因序列作圖分析。

2 結果與分析

2.1 優勢菌的分離及形態學觀察

從寧波本地自然腐爛的柑橘果實上共分離出6株菌，分別記為A、B、C、D、E、F。菌株A在PDA培養基上菌落呈絨狀，圓形，基本上無氣生菌絲；菌絲開始為白色，逐漸變為青綠色；基質顏色為白色。顯微鏡觀察其菌絲頂端具有1～3 個分枝，掃帚狀；有分生孢子梗和分生孢子，且分生孢子無色，近球形（圖版-A）。

菌株B在PDA上的菌落邊緣不整齊，菌絲較長，初期為灰白色，逐漸長滿平皿，最終轉為灰褐色至黑色。鏡檢顯示分生孢子大都呈卵形，暗褐色，菌絲體不分枝，具隔膜（圖版-B）。

菌株C在PDA上菌落成絨狀，綠色，基質顏色由綠色變為黑灰色；鏡檢觀察菌絲體不分枝，具隔膜，分生孢子為卵形（圖版-C）。

菌株D在PDA培養基上菌落呈粉粒狀，菌落較小邊緣清晰，菌絲體為墨綠色；鏡檢顯示分生孢子梗末端膨大成圓形，產生分生孢子（圖版-D）。

菌株E在PDA上菌落生長較快，呈液體狀，粉紅色，無菌絲。鏡檢觀察其菌體成卵圓形，分裂生殖（圖版-E）。

菌株F在PDA上菌落生長較快，菌落小且為白色，呈凸起狀，有特殊氣味。鏡檢觀察菌體為圓形（圖版-F）。

根據形態特征及鏡檢結果， 參照魏景超[14]的真菌鑒定手冊，初步判定的結果為： A為半知菌亞門青霉屬，B為半知菌亞門鏈格孢屬，C為半知菌亞門枝孢霉屬，D為半知菌亞門曲霉屬，E為擔子菌亞門鎖擲孢酵母屬，F為子囊菌亞門畢赤氏酵母屬。

2.2 菌株的致病性檢測

A菌株接種在柑橘果實后，1 d后開始發病，在果皮表面起始為水漬狀，之后快速形成白色菌絲，在果皮表面迅速擴展，最后形成青綠色霉層。B菌株在柑橘表面形成干疤，病斑褐色，通常為圓型。C菌株侵染柑橘果實后，首先在表皮長出白色菌絲，接種3天后完全形成墨綠色霉層。D菌株在果皮及內部形成病斑，開始為深褐色水漬狀病斑，逐漸長出白色菌絲，其后上生出大量的分生孢子最后形成墨綠色霉層。E菌株接種到柑橘果實后，果實未見明顯變化，7 d后傷口結疤。F菌株接種柑橘果實后，未見明顯發病癥狀。初步斷定A、B、C、D為柑橘采后病原菌，且A、C為導致柑橘腐爛的主要致病菌；E、F可能為酵母菌。

2.3 菌株rDNA-ITS 序列分析

將測序結果與GenBank 上已登錄的基因序列進行比對，選取相近的參考菌株，利用MEGA4. 1 軟件基于18S rDNA 序列采用NJ法構建系統發育樹，確定其進化地位，結果如圖1所示。

從系統發育樹來看，A與P. digitatum親緣關系較近，與 GenBank 中的基因序列比對后，A與P. digitatum的相似性為99%，因此，初步將A鑒定為P. digitatum。B與Alternaria citri在親緣關系上最近，經 GeneBank 中比對，基因序列相似性高達為99%，將B在分類學地位上歸于A. citri。C、D分別與C. cladosporioides和A. sydowii 聚在一起，親緣關系較近，可將其歸為C. cladosporioides和A. sydowii。E、F與S. pararoseus和P. caribbica的遺傳距離最近，在 GeneBank 中比對，相似性也分別達到99%和100%，因此，將其分別歸為S. pararoseus和P. caribbica。

結合傳統形態學特征，綜合鑒定結果為：A為指狀青霉P. digitatum，B為柑橘鏈格孢A. citri，C為枝孢樣枝孢霉C. cladosporioides，D為聚多曲霉A. sydowii，E為近玫色鎖擲孢酵母S. pararoseus，F為卡利比克畢赤酵母P. caribbica。

2.4 丁香精油對P. digitatum和C. cladosporioides的抑制中濃度（EC50）和最小抑制濃度（MIC）

從表1可以看出，丁香精油對P. digitatum有一定的抑制效果，且隨著丁香精油濃度的增加而增加。當濃度為6 mL·L-1時，菌絲延伸量為0，此時為丁香精油對P. digitatum的最小抑制濃度（MIC）。通過計算各處理組的菌絲抑制率，建立毒力回歸方程為y=0.815 9x+1.045 1（R2=0.964 2），根據方程，計算出丁香精油對P. digitatum的抑制中濃度（EC50）為2.15 mL·L-1。

從表2可知，丁香精油對C. cladosporioides的抑制效果隨著濃度的增加而增加，其對C. cladosporioides的MIC為3 mL·L-1。計算各處理組的菌絲抑制率，建立毒力回歸方程為y=0.8159x+1.0451（R2=0.9642），得出丁香精油對C. cladosporioides的EC50為0.57 mL·L-1。結合兩表可以看出，丁香精油對P. digitatum和C. cladosporioides的抑制效果不同，尤其對C. cladosporioides的抑制效果更佳。

3 討 論

由于rDNA- ITS 是介于5.8S rDNA、18S rDNA和28S rDNA 之間的區域，有研究表明ITS在真菌種內不同菌株間高度保守可以為真菌的系統分類提供相應的遺傳信息。而多數真菌菌落外觀不易描述，且其顯微結構和菌落形態也會受到培養基等因素的影響發生不同或變異，單純依據傳統形態學進行分類，結果不可靠。所以，現代分子學手段已發展應用在檢測真菌病害或鑒定系統的領域內[15-16]。本試驗結果表明，傳統形態學可將菌株鑒定到屬，結合了rDNA- ITS分子標記法，能將菌株鑒定到種的水平上。綜合所得，浙江寧海本地產柑橘采后主要致病菌為P. digitatum、A. citri、C. cladosporioides、A. sydowii。雖然國內外學者普遍認為意大利青霉（P. italicum） 與指狀青霉（P. digitatum）是引起柑橘采后腐爛的主要致病菌，也有文獻[17]證實柑橘鏈格孢（A.citri）為柑橘致病菌，然而，可能由于產地、品種、管理條件、氣候等的不同，導致引起柑橘采后腐爛的致病菌發生了變化。

從柑橘上分離所得的卡利比克畢赤酵母（P. caribbica）在柑橘致病性檢測試驗中柑橘在10 d后病斑與P. digitatum引起的病斑極相似，因此應為柑橘發病中后期的病害拮抗菌，在短時間內對致病菌有拮抗作用。有研究表明許多酵母菌對果蔬采后的病害具有抑制作用，酵母能夠產生葡聚糖酶、幾丁質酶等孢外水解酶可以分解病原菌的細胞壁或菌絲體從而破壞病原菌的生長代謝[18]。研究比較廣泛的拮抗酵母菌有隱球酵母屬、畢赤氏酵母屬、假絲酵母屬等，其中畢赤氏酵母屬對柑橘[19]、櫻桃[20]、葡萄[21]等采后病害有明顯抑制效果，并且已應用于商業生產。而分離所得的近玫色鎖擲孢酵母（S. pararoseus）相關研究報道較少，是否為拮抗酵母有待于進一步研究。

通過培養基加藥法研究了丁香精油對P. digitatum和C. cladosporioides的抑制效果。試驗表明，丁香精油對這兩株菌有不同程度的抑制效果，由于不同菌種之間對丁香精油的耐受程度不同，所表現出來的抑制效果也不同。丁香精油的主要成分為丁香酚，含量高達60%。而植物精油一般作用于脂質膜[22]，丁香酚與細胞膜中的磷脂發生反應，影響膜的結構，改變細胞膜的通透性，導致生物體內離子泄露，并且引起胞內損傷從而抑制微生物的生長。目前對于植物精油的抑菌機理主要集中在細胞壁、膜的影響上，其更深層次的機理在今后仍需進一步的研究。

4 結 論

結合傳統的形態學方法和rDNA- ITS分子標記法分析浙江寧海本地柑橘采后致病菌，同時研究丁香精油對主要致病菌的抑制作用。研究結果表明，柑橘上分離得到指狀青霉（P. digitatum）、柑橘鏈格孢菌（A. citri）、枝孢樣枝孢霉（C. cladosporioides）和聚多曲霉（A. sydowii）這4種致病菌；其中，優勢腐敗菌為P. digitatum和C. cladosporioides。同時，分離出近玫色鎖擲孢酵母（S. pararoseus）和卡利比克畢赤酵母（P. caribbica）；丁香精油對P. digitatum和C. cladosporioides有較好的抑菌效果，抑制中濃度（EC50）分別為2.51 mL·L-1和0.57 mL·L-1；最小抑菌濃度（MIC）分別為6 mL·L-1和3 mL·L-1。說明丁香精油可以成為一種新的柑橘采后防腐保鮮方法，具有較大的商業應用前景。（本文圖版見插1）

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