錐栗植株再生體系的建立

楊志堅　馮金玲　陳輝

摘 要： 【目的】為了建立錐栗再生體系，【方法】以錐栗胚為外植體，分析不同基因型、基本培養基及激素組合對錐栗不定芽的誘導、增殖和生根的影響。【結果】結果表明，油榛是錐栗組織培養最佳的基因型；錐栗不定芽誘導的最適培養基為M（NH4NO3 804 mg·L-1+ KNO3 1011 mg·L-1 +FeSO4·H2O 27.8 mg·L-1 + 1/2MS 其余無機鹽 + MS有機）+6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1，其出芽率為76%；芽增殖的最佳培養基為M（同上）+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1，其增殖倍數達18；誘導生根的最佳培養基為M（同上）+IBA 0.5 mg·L-1，其生根率為48%。【結論】運用上述體系可獲得完整錐栗再生植株。

關鍵詞： 錐栗； 組織培養； 植株再生

中圖分類號：S664.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0105-05

錐栗（Castanea henryi）屬殼斗科栗屬，是我國著名的木本果材兼用樹種。其人工林主要集中在閩北和浙南，已成為閩北地區重要的經濟林樹種之一[1]。錐栗果實外形光潔美觀、果肉細嫩香甜， 含有淀粉、糖、蛋白質等主要營養成分及18種鈣、鋅、磷、鉀、鐵等礦物質，深受消費者青睞，在國際市場中具有強大的競爭力。錐栗栽培品種多且亂，為了保持其優良特性，目前繁殖大部分采用扦插、嫁接等無性繁殖方法，但扦插受限于生根率和優質插條的數量，嫁接受砧木與接穗親和力、接穗數量和生活力以及生長環境等因素的影響，同時扦插和嫁接出苗周期長，造成它們擴繁速度慢，育苗效率低，在種質資源有限的條件下不能滿足錐栗良種的大量推廣[2]。而組織培養快速繁殖苗木，不僅可以加速良種繁育，而且在離體條件下群體大，實驗條件易于控制，不受時間和季節的限制，并在一定程度上保持母本的優良性狀。近來學者對錐栗的生理生化、良種繁育、生態、栽培技術、病蟲害、加工利用等方面開展了研究[3]，但對錐栗組織培養的研究相對較少，迄今為止，未見錐栗再生體系建立的研究報道[4-5]。我們進行錐栗組培快繁技術和再生體系的研究，旨在為遺傳改良研究提供基礎和進一步加快錐栗優良品種的推廣應用。

1 材料和方法

1.1 材料

14個錐栗品種均來自福建省建甌市水源鄉，每份材料采集健康飽滿的種子 200 粒。

1.2 方法

1.2.1 無菌外植體的建立 將錐栗種子放在流水中沖洗 10 min，剝去果殼，取出種仁，經 70% 酒精浸潤 30s 左右，移到含有吐溫 80 的 0.2%HgCI2 溶液中消毒 8 min，接著用無菌水搖洗4～5遍，每次搖洗時間不少于 1 min，放到滅菌濾紙上， 吸干表面水分[5]。在超凈工作臺上用解剖刀切開種仁，取出種胚接種到初代培養基上。

1.2.2 基因型篩選 將14個供試材料（表1）的成熟胚為材料，消毒后，接種于MS+BA1 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1 培養基中[5]，其中蔗糖 40 g·L-1，瓊脂 7g·L-1，pH 為 5.5。每處理接 50 個外植體，重復 3 次。接種材料置于溫度 （26±1）℃，空氣相對濕度 50%～60%，光照 12 h·d-1，光照度為1 500～2 000 lx。30 d 后統計分化率，觀察材料狀態。

1.2.3 基本培養基 以油榛的成熟胚為材料，消毒后，接種于按無機鹽和有機鹽含量高低選取White、WPM、MS、1/2MS（1/2的大量元素）、改良 MS 以及 M（NH4NO3 804 mg·L-1+ KNO3 1 011 mg·L-1+ FeSO4·H2O 27.8 mg·L-1+ 1/2MS 其余無機鹽 + MS有機） 這 6 種基本培養基作為錐栗胚誘導、分化、增殖的基本培養基，分別加入激素 BA 1 mg·L-1和 NAA 0.5 mg·L-1，其余條件同上。1 個月后觀察。

1.2.4 叢生芽誘導 以油榛的成熟胚為材料，消毒后，取無菌胚接種于培養基上。基本培養基為M，添加不同的分裂素濃度 6-BA（1、2 、0.5 mg·L-1），不同類型的生長素 （IAA、NAA、IBA） 及不同濃度的 IBA（0.1、0.2、0.5 mg·L-1）[4]進行組合實驗。其余條件同上。1 個月后觀察。

1.2.5 不定芽的增殖 將初代培養的芽長至 5～6 個葉芽時，分割，接入增殖培養基。以 M 為基本培養，蔗糖 30 g·L-1、瓊脂 6 g ·L-1，pH 5.5，附加 6-BA（0.25、0.5、1 mg·L-1）、IBA（0.1、0.2、0.3 mg·L-1）、0.1 mg·L-1（IAA、NAA、IBA）進行激素組合實驗。培養條件同上。觀察記錄，30 d 后繼代1次。

1.2.6 生根培養 不定芽伸長至2.0～3.0 cm時自基部切下，移至生根培養基。基本培養基為White、1/2 MS、M。蔗糖 30 g·L-1，瓊脂 6 g·L-1， pH5.5，附加 IBA（0.3、0.5、0.7 mg·L-1）、0.5 mg·L-1（IAA、NAA、IBA）、0.1 mg·L-1 6-BA 進行組合實驗。培養條件同上。培養30 d 后，記錄試驗結果，觀察記錄每個組合不定芽的生根狀況及芽的生長反應情況。生根率（%）=生根苗數量/外植體數量×100。

1.2.7 煉苗及移栽 移栽時選擇粗壯、均一、長勢好，無變異的試管苗，先移到自然光的環境中煉苗 2 d，再開口煉苗 2 d 后移栽。在瓶內倒入適量清水，搖動使培養基與幼苗分離，用鑷子把幼苗取出，迅速用水沖洗粘附在根部的培養基，移植于沙質中，用 1/2MS 溶液保濕培養 15 d 后，移栽到營養土中正常栽培管理。

2 結果與分析

2.1 基因型對錐栗不定芽誘導的影響

將 14 個供試材料的胚外植體消毒后，接種于 MS+BA1 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1分化培養基中， 7 d 左右外植體膨大，14 d 左右可見綠色的芽點（圖版-A），1 個月后14個品種的芽分化率為 0.12～0.72，品種之間存在著明顯差異（表 1），長勢見（圖版-B）。‘壩頭子、‘歐寧子、‘處署紅的長勢最差，‘油栗子、‘烏榛長勢在 14 個品種中最好。綜合外植體分化率和長勢，得出‘油榛是最好的實驗材料。

2.2 基本培養基對錐栗不定芽的影響

以‘油榛胚為材料，選用附加激素的 6 種培養基進行培養，1 個月后進行統計（表 2）發現，芽分化率 0.32～0.84，差異明顯。同時分化出的不定芽長勢差異也較大，White、1/2MS 培養基芽勢弱，MS 分化出的不定芽壯且伴有大量愈傷組織生長，WPM、改良 MS 褐變嚴重，M 培養基分化出的不定芽壯，但伴有少量愈傷組織。

2.3 不同激素組合對錐栗不定芽分化誘導的影響

以‘油榛的胚為材料，以M為基本培養基，分別附加不同激素組合進行不定芽誘導，每處理 50 個外植體。1 個月后觀察不定芽分化率（表3）， 1.0 mg·L-1 6-BA 與0.5 mg·L-1 IBA 組合時分化率最高，其次分別為 0.5 mg·L-1 NAA 和 0.5 mg·L-1 IAA。在IBA為 0.5 mg·L-1，2 mg·L-1的 6-BA 分化率高于 1 mg·L-1的6-BA的分化率。在 6-BA 為 2.0 mg·L-1，IBA 為 0.2 mg·L-1 時，胚不定芽分化率最高，達到 92%。

故不定芽分化的培養基為 M+6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1+蔗糖4.0%+瓊脂粉0.6%，pH 5.5。

2.4 不同激素組合對錐栗不定芽的增殖的影響

將不定芽分別接種含有不同激素種類及其配比的 M 培養基中，進行增殖實驗，每個處理50 個外植體，一個月后觀察（圖版-C，D，表4）。各個處理之間的增殖倍數變化幅度大，為1～18，其中倍數最高的是6-BA 0.5 mg·L-1 和IBA 0.1 mg·L-1的組合。從生長狀況看，不同類型的生長素對芽生長影響不同，IBA 增殖的芽正常，IAA 促進節間伸長，NAA 有利于根毛分化；高濃度的分裂素促進愈傷形成；適當濃度的IBA 有利于不定芽的增殖。

故芽增殖的最優培養基為 M+6-BA0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+蔗糖3.0%+瓊脂粉0.6%，pH 5.5。

2.5 不同激素組合對錐栗不定芽的生根的影響

將不定芽分別接種M基本培養基中，每處理 50 個外植體。 15 d 左右不定根開始形成，1 個月后形成發達根系（圖版-E，F），并觀察其生根率和根的生長狀況（表5）。從整體上看，錐栗的生根率比較低。3種基本培養基生根率最高的是M，其次是 1/2MS，最低的是 White 基本培養基，為0。從根的生長狀況看，M基本培養基生根質量最好。在錐栗生根中，分裂素起抑制作用，生根率為 0。3種生長素的生根作用存在著差異，生根率最高的是 IBA，且根系質量也最好；最低的是NAA為 0.12。不同濃度 IBA 對生根影響也有明顯差異，過高或過低都不利于錐栗不定芽的生根。

綜上所述，最優生根培養基是 M +IBA0.5 mg·L-1+蔗糖3.0%+瓊脂粉0.6%，pH 5.5。

2.6 移栽成苗

移栽時，選擇根長 3 cm 左右，粗壯、均一、長勢好，無變異的試管苗，先移到自然光的環境中煉苗 2 d，再開口煉苗 2 d 后移栽。在瓶內倒入適量清水，搖動使培養基與幼苗分離，用鑷子把幼苗取出，迅速用水沖洗根部，移植于沙質中（圖版-G），用 1/2MS 溶液保濕培養 15 d 后，移栽到營養土中正常栽培管理。成活率 75%。

3 討 論

前人[6-8]報道，基因型的選擇對于能否獲得再生植株十分重要。本研究得到，以胚為外植體，錐栗不同品種在不定芽誘導和分化中存在明顯差異。‘油榛分化率最高，達到 0.72；‘壩頭子最低，僅為 0.12。這是因為錐栗不同品種遺傳控制再生能力或對誘導條件的要求不同存在差異[9]，從而造成了不同基因型供體植株發育狀態的差異。

基本培養基是植物組織培養重要的基質，由于各種植物的遺傳特性，生物學特性和生態學特性不一樣，因而各種植物需求的營養成分也不盡相同，對培養基成分要求也有差異[10]，同時器官發生的不同時期對培養基的要求是不一樣的[11]。本課題組在錐栗組織培養初期得出，適合錐栗胚分化的基本培養基是 White[4]，但本次試驗得出錐栗組織培養最適宜的基本培養基為M。這是因為雖然 White 基本培養基中的分化率很高，但芽的質量不好，有可能是 White 基本培養基中無機鹽含量低有利于胚分化，有機質含量不高造成芽生長不好。而M基本培養基用有機質含量高的 MS作基礎降低大量元素含量，即 NH4NO3 804 mg·L-1+ KNO31011 mg·L-1 + FeSO4·H2O 27.8 mg·L-1+ 1/2MS 其余無機鹽 + MS有機。因此是最適宜的基本培養基是 M。同時也說明錐栗組培適合于總鹽量中等及銨態氮和硝態氨的比值為1的培養基。

在木本植物器官發生過程中，細胞分裂素和生長素對芽的誘導和生長發育均起著重要的作用，一般誘導不定芽的形成時細胞分裂素高于生長素的用量或只用細胞分裂素；而誘導不定根發生只用生長素或配合使用較低濃度的細胞分裂素[12]。本試驗結果也類似，芽分化中 6-BA 2.0 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1組合效果好，芽增殖實驗中 6-BA0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1的組合效果最好。生根激素 IBA0.5 mg·L-1。在激素配比中，分裂素與生長素的比例為 10 時，錐栗分化不定芽效果最好；比例為 5 時，增殖效果最好；但分裂素對錐栗不定芽生根有抑制作用。這有可能是因為隨著繼代次數的增多，激素的含量和比例相對降低[13-14]，且由于有不同種類植物激素的生理效應相互促進和相互拮抗，影響植物生理生化的合成、運輸、代謝及效應導致每一個培養階段只需一定范圍的濃度和配比[15]。在 6-BA 與不同類型的生長素組合中，IBA 對錐栗組織培養效果最好，其次是 NAA，最后是 IAA。這也許是IAA是一種內源激素，在外界環境中易分解的原因[16-17]。

在錐栗組織培養研究過程中也存在一些問題。首先錐栗不定芽分化率不高。這有可能是因為錐栗為多年生的木本植物，次生代謝旺盛且復雜，易導致組培過程中發生褐變。本實驗通過基因型選擇和基本培養基中大量元素的調節，在保證有效的控制褐變的前題下，提高不定芽分化率。其次生根率低，是因為錐栗本身就是難生根的物種[1]，而且對于木本成年樹來說，不定芽生根的問題是整個培養過程中最難克服的[18]。（本文圖版見插3）

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