不同蘋果砧木組培苗抗旱性的比較研究

張靜　趙亮明　鄒志榮

摘 要： 【目的】為了提供蘋果耐旱育種及栽培材料，【方法】以5種蘋果砧木組培苗為試材，PEG-6000作為脅迫劑，模擬室外干旱進行處理，運用模糊隸屬函數抗旱性綜合分析，比較了5個蘋果砧木組培苗的耐旱性。【結果】結果表明，在PEG-6000脅迫條件下，不同蘋果砧木的葉綠素含量總體均呈下降趨勢，葉片的相對電導率和MDA含量隨PEG-6000脅迫質量分數的升高逐漸升高。在整個脅迫過程中，各蘋果砧木組培苗葉片內蛋白質含量隨脅迫質量分數的升高而增大。SOD活性隨PEG-6000脅迫質量分數的升高呈先升高后下降趨勢，且在20%PEG-6000脅迫條件下SOD活性達到了最大。POD活性隨脅迫質量分數的升高呈現出逐漸升高的趨勢。【結論】5種蘋果砧木的抗旱性順序依次為：新疆野蘋果>平邑甜茶>八棱海棠>‘M26>‘M9。

關鍵詞： 蘋果砧木組培苗； PEG-6000脅迫； 抗旱性評價

中圖分類號：S661.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0088-06

蘋果是世界上栽培的主要果樹，也是我國果樹栽培中面積最大的樹種。干旱是影響苗木成活與生長的重要限制因子[1]，也是一種影響植物生產最普遍的環境脅迫[2]，更是導致減產最嚴重的環境脅迫[3]。全球范圍內因干旱導致的作物產量損失超過其他環境脅迫造成減產總和[4]，2005年巴西干旱缺水，導致巴西全國蘋果產量直接減少35%[5]。因此選育抗旱性強的蘋果砧木，用于維持蘋果產量與品質、擴大栽培面積一直是干旱地區果樹栽培的主要任務[6]。蘋果樹常規育種周期長，占地面積大，限制了耐旱性品種的選育與篩選。前人對蘋果種質資源的抗旱性研究已為抗旱蘋果品種的選育提供了很多理論依據[7]，但蘋果砧木的抗旱性鑒定仍存在不少問題，例如：（1）對蘋果矮化砧木和喬化砧木的抗旱性沒有比較研究；（2）對品種的抗旱性鑒定花費時間長。而植物組織培養可以通過轉基因手段或篩選基因突變體來縮短培育周期，有利于果樹樹種的選育。迄今國內外有關蘋果組培苗抗旱性研究的相關報道較少，僅趙軍營[8]對‘嘎拉蘋果進行過相關研究。本研究首先在材料選擇上選取了矮化砧木‘M9、‘M26和喬化砧木八棱海棠、平邑甜茶、新疆野蘋果進行對比，同時利用這些材料的組培苗作為試材，通過研究其對PEG-6000脅迫的反應，從而建立高效的蘋果幼苗抗旱性早期鑒定技術體系，為蘋果抗旱無性系篩選及資源鑒定提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗于2009年3月于西北農林科技大學蘋果示范基地進行，以‘M9、‘M26、八棱海棠（M. micromalus Mak.）、平邑甜茶（M. hupehensis Rehd.）和新疆野蘋果[M. sieversii （Ledeb） Roem.]5個蘋果屬樹種的1 a生枝條為試材。將上述材料置于27 ℃溫室內水培，每升水中加入1/8MS和5 g蔗糖，誘導芽的萌發，每5 d換水1次[9-10]。待芽長至1.5～2.0 cm 時，剪取嫩芽去掉大葉，在自來水下沖洗3～4 h，用體積分數為75%的酒精消毒10 s，結合質量分數為0.1%升汞消毒8 min后，用含50 mg·L-1抗壞血酸的無菌溶液沖洗3～4次莖尖后[11]，接種到MS+6-BA1.0 mg·L-1 +NAA0.1 mg·L-1附加500 mg聚乙烯吡咯烷酮的培養基中培養，待新芽長出后，切取新芽接入繼代培養基（MS培養基加6-BA0.5～1.0 mg·L-1，IBA0～0.5 mg·L-1）中增殖。每瓶內接3～4個芽，光照12～14 h·d-1、光照強度2 000 lx，25 ℃條件下培養。

1.2 方法

不同材料的脅迫培養基為繼代培養基附加不同質量分數的PEG-6000，分別為 0 （CK）、10% （B1）、15% （B2）、20% （B3）、25%（B4），共5水平，重復3次。在無菌條件下將培養到第4 代的不同蘋果砧木組培苗修剪成1.0 cm左右帶頂芽的莖段，接種于設計的培養基上，每個品種每一處理各接種20瓶，置于培養室內培養。培養條件：光照時間為12 h /d，光照強度為2000 lx，培養溫度為 23～27 ℃， 相對濕度為50%～70%。培養30 d后進行不同指標的測定。

1.3 測定指標與方法

葉綠素含量和電導率的測定參照劉世鵬[12]的方法。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白（Pr）含量均參照孫群等[13]的方法測定。

1.4 蘋果砧木抗旱性評定

植物抗旱性強弱受多種因子影響，通常用單一指標無法正確的評定，因此本試驗通過對實驗結果進行隸屬函數[14]分析，對5種蘋果砧木的抗旱性進行綜合評價，從而比較各品種的抗旱性強弱。其計算公式如下：

1.5 統計分析

應用SA8.1統計軟件進行Duncans新復極差顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 PEG-6000脅迫對苗葉綠素含量的影響

葉綠素是反映光合作用強度的重要指標，在干旱脅迫條件下，抗旱性越強，葉綠素含量下降的幅度越小。由表1可知，隨著PEG-6000脅迫程度的加重，各砧木葉片的葉綠素含量總體上均呈現下降趨勢，且葉綠素降低程度因品種差異而表現不同。在25% PEG處理下‘M9、‘M26、八棱海棠、平邑甜茶、新疆野蘋果的相對葉綠素含量與對照相比分別下降了45.64%、52.01%、34.58%、12.07%、7.20%。由此可知，平邑甜茶和新疆野蘋果的葉綠素含量下降幅度小。且除平邑甜茶在P< 0.05水平上，對照與B1及B2差異不顯著外，其他品種各質量分數間均表現差異顯著。

2.2 PEG-6000脅迫對葉片可溶性蛋白的影響

蛋白質是植物體內重要的滲透調節物質之一，含量的多少直接反映植物的生長狀況，含量越多抗旱性越強。由表2可知，5個供試蘋果砧木的對照與不同質量分數PEG-6000脅迫處理下可溶性蛋白含量差異顯著。在整個脅迫過程中，各蘋果砧木葉片內蛋白質含量隨脅迫質量分數的升高而增大，在B4條件下，‘M9、‘M26、八棱海棠、平邑甜茶和新疆野蘋果葉片中可溶性蛋白質含量也達到了最大，與對照處理相比可溶性蛋白質含量分別增加了38.75%、63.45%、49.94%、102.78%、122.93%。

2.3 PEG-6000脅迫對葉片質膜相對透性的影響

電導率的大小直接反應植物的抗逆性，值越大，抗性越弱。從表3可以看出，不同蘋果砧木葉片的相對電導率隨PEG-6000脅迫質量分數的升高而逐漸升高，且葉片質膜的相對透性增加幅度各不相同。各蘋果砧木的相對電導率，在各質量分數處理與對照處理相比差異均顯著。在B4質量分數脅迫處理下，‘M9、‘M26、八棱海棠、平邑甜茶和新疆野蘋果的相對電導率與對照處理相比增加幅度依次為14.431%、11.891%、10.332%、7.790%、7.865%。由此可知新疆野蘋果和平邑甜茶的抗旱性較‘M9、‘M26、八棱海棠的強。

2.4 PEG-6000脅迫對葉片SOD、POD活性的影響

超氧化物岐化酶（SOD）是植物保護系統中的主要保護酶，在此系統中處于核心地位，它的活力與植物的抗性關系密切。過氧化物酶（POD）能清除體內過多H2O2等過氧化物，是細胞內防御酶系統中體內自由基的清除劑。隨著干旱脅迫的加劇，不同植物體表現出得活性不同。由表4可以看出，SOD活性隨PEG-6000脅迫質量分數的升高表現為先升高后下降，各處理間差異均顯著。在B3條件下‘M9、‘M26、八棱海棠、平邑甜茶和新疆野蘋果的SOD活性均最高，分別是對照的1.22、1.15、1.23、1.24和1.78倍。

從表5可看出，不同蘋果砧木POD活性變化隨處理質量分數的增大呈逐漸升高的趨勢。在脅迫處理后的30 d，與對照相比，B4處理POD活性分別提高了： ‘M9 1.376倍，‘M26 1.347倍，八棱海棠1.572倍，平邑甜茶1.425倍，新疆野蘋果1.393倍。方差分析表明，5個供試蘋果砧木的POD活性對照與不同質量分數PEG-6000脅迫處理差異顯著。在P< 0.05水平上，除新疆野蘋果CK與B1不顯著外，其他品種的砧木均表現為差異顯著。

2.5 PEG-6000脅迫對葉片丙二醛（MDA）含量的影響

丙二醛是膜脂過氧化的主要產物之一，其含量多少可以直接反映植物受害程度。干旱脅迫越嚴重，MDA含量越大，植物的抗旱性越弱。從表6可知，PEG-6000脅迫過程中，5種蘋果砧木的丙二醛含量隨著脅迫質量分數的升高均有所增加， 5個供試蘋果砧木的MDA含量在對照與處理間差異均顯著，在B4處理下，與其對照相比，各砧木丙二醛含量增加量依次為‘M9 4.357 mmol·g-1、‘M26 3.688 mmol·g-1、八棱海棠3.417 mmol·g-1、平邑甜茶2.582 mmol·g-1、新疆野蘋果3.389 mmol·g-1。

2.6 蘋果砧木組培苗抗旱性綜合評價

本研究以不同脅迫質量分數下各指標平均值的隸屬函數加權平均值作為品種抗旱性的綜合評定標準，這樣消除了個別指標帶來的片面性，使各品種抗旱性差異具有可比性。平均隸屬值越大抗旱性越強。由表7可以知，新疆野蘋果的隸屬值最大，表明其抗旱性最強，而‘M9的隸屬值最小，則抗旱性最弱。由此得出這幾種蘋果砧木的抗旱性依次為：新疆野蘋果>平邑甜茶>八棱海棠>‘M26>‘M9。

為了進一步研究6個蘋果砧木抗旱性指標間的協同變異程度， 對上述材料的SOD、POD活性，可溶性蛋白（Pr）含量，丙二醛（MDA）含量，葉片相對電導率（REC），葉綠素（Chl）含量進行了相關性分析（表8） 。由此表可以看出，用平均隸屬值評價蘋果砧木抗旱性最為科學。他與其他6個指標間的相關系數均達到了顯著水平。決定系數均在0.5以上，說明可以用平均隸屬值來代表其他6個指標表示蘋果砧木抗旱性的大小。而其他6個指標間的相關性則相對較差。相對電導率與葉綠素，POD之間呈極顯著正相關。可溶性蛋白與葉綠素之間呈極顯著正相關。電導率大小反映出蘋果葉片在干旱脅迫下細胞膜相對透性的變化，而葉綠素的變化則代表蘋果砧木葉片葉綠體受害程度的大小，二者之間極顯著正相關，說明在干旱脅迫條件下，葉綠素含量越小，葉片細胞在干旱脅迫下的傷害就越大，蘋果砧木的抗旱性越差。可溶性蛋白含量的多少反映蘋果砧木葉片滲透調節的能力，含量越多調節能力越強，抗旱性也越強。并且認為可溶性蛋白、葉綠素和電導率可作為鑒定組培苗抗旱的特定指標。

3 討 論

干旱脅迫下，葉綠體結構受損，導致葉綠素含量下降[16]，試驗研究表明，5種蘋果砧木葉綠素含量的變化隨脅迫濃度的質量分數的升高基本上呈下降趨勢，新疆野蘋果表現為先下降后升高然后再下降，但總體上呈現下降趨勢。蛋白質因參與植物體內各種代謝，對滲透調節有一定的貢獻作用[17]，它含量的多少直接反映植物的生長狀況。本研究表明，隨著脅迫質量分數的增大，各蘋果砧木葉片內可溶性蛋白含量也達到了最大，說明可溶性蛋白對干旱脅迫的反應是敏感的。

質膜是植物抵御外界環境脅迫的第一道屏障，在環境脅迫下，植物細胞膜會受到不同程度的傷害。葉片相對電導率是反映葉片細胞膜受傷害的重要指標。細胞電解質外滲是細胞膜脂過氧化的必然結果。抗性越低，葉片質膜的相對電導率增幅越大[18]。新疆野蘋果的增幅最小為7.865%，‘M9的增幅最大為14.431%。

植物的光合作用和呼吸作用因干旱脅迫受到抑制，體內產生大量的活性氧自由基，導致細胞膜脂過氧化[19]和破壞膜結構[20]，但由于體內抗氧化酶系統的存在，因品種不同而表現的活性不同。本研究發現在PEG-6000脅迫質量分數逐漸加大的情況下SOD活性呈現先上升后下降的趨勢，在20%PEG-6000質量分數處理下達到了最大，POD活性表現為始終上升。這與李霞等[21]在對黃檗保護酶活性的研究一致。SOD在脅迫質量分數最大時出現下降的情況，可能是由于細胞膜受到傷害，抗氧化酶活性被抑制的結果。這也表現出SOD比POD更容易受PEG-6000脅迫誘導。

在逆境脅迫下植物活性氧代謝失調，導致活性氧累積和膜脂過氧化損傷，造成丙二醛累積，脅迫越嚴重，MDA含量越大，則膜脂過氧化損傷越嚴重，抗旱性也越差[22]。

蘋果的抗旱機制是一個復雜的生理生化變化過程，受多種因素影響，單一依靠一種或少數幾個生理指標作為抗旱性強弱鑒定的依據是不太可靠的，并且很難反映其抗旱本質。本實驗通過檢測葉片相對電導率和MDA含量得出的結論就有差別。因此本文采用隸屬函數法對供試材料進行了抗旱性鑒定，這樣既消除了個別指標的片面性又使得各品種或種抗旱性差異具有可比性，最終將這幾種蘋果砧木的抗旱性劃分為4類：高抗：新疆野蘋果；中抗：平邑甜茶和八棱海棠；低抗：‘M26；不抗：‘M9。新疆野蘋果與平邑甜茶的研究結果與譚冬梅[23]研究結果一致，‘M26的抗旱性與閆芬芬[24]研究結果相似。并將平均隸屬函數值與6項生理指標進行了相關性分析，結果表明隸屬函數值與6項指標間均達到了顯著相關，決定系數均達到了0.5以上，因此可以用平均隸屬值來代替6項生理指標所代表的抗旱性。

4 結 論

采用鑒定組培苗可溶性蛋白、葉綠素和電導率這三種特定生理指標可預測后期苗子的抗旱性。最終得出這5種蘋果砧木的抗旱性為新疆野蘋果>平邑甜茶>八棱海棠>‘M26>‘M9。從研究材料和實驗結果看，喬化砧木的抗旱性要高于矮化砧木的抗旱性。

參考文獻 References：

[1] BECKER M， NIEMINEN T M， GEREMIAF F. Short-term variationand long-term changes in oak productivity in northeastern France. The role of climate and atmospheric CO2[J]. Annales Des Sciences Forestieres， 1994， 51： 477-492.

[2] CHAVES M M， MAROCO J P， PERIERA S. Understanding plant responses to drought from genes to the whole plant[J]. Funct Plant Biol， 2003， 30： 239-264.

[3] SEHGAL Deepmala and YADAV Rattan. Molecular markers based approaches for drought tolerence[J]. Molecular Techniques in Crop Improvement， 2009， 2：207-230.

[4] FAROOQ M， WAHID A， KOBAYASHI N， FUJITA D，BASRA S M A. Plant drought stress effects， mechanisms and management[J]. Agronomy for sustainable development， 2009， Part 1，153-188.

[5] JERRY. Apple Production Affected by Drought In Brazil In 2005. [EB/OL]. 2005-03-29. hattp//：jjlxx.forestry.gov.cn.

[6] LEGAY S， LEFVRE I， LAMOUREUX D， BARREDA C， LUZ R T， GUTIERREZ R， QUIROZ R， HOFFMANN L， HAUSMAN J F， MERIDETH B， EVERS D， SCHAFLEITNER R. Carbohydrate metabolism and cell protection mechanisms differentiate drought tolerance and sensitivity in advanced potato clones （Solanum tuberosum L.）[J]. Functional Integrative Genomics， 2011， 11（2）： 275-291.

[7] ZHAO Chang-jie， LIU Song-zhong， ZHANG Qiang. Research and progress in response to drought stress in fruit trees[J]. China Fruits， 2001（4）： 60-62.

趙昌杰，劉松忠，張強. 果樹對干旱脅迫的響應研究進展[J].中國果樹，2011（4）： 60-62.

[8] ZHAO Jun-ying， LI Shao-hua， DAI Zhan-wu， FAN Pei-ge. Effect of half-and whole-rhizoshpere droughts on osmosis-regulating substanes in vitro seedings of Gala apple （Malus Pumila Mill.）[J]. Acta Boreal.-Occident Sin，2005， 25（12）： 2484-2489.

趙軍營，李紹華，代占武，范培格. 半根和全根干旱對嘎啦蘋果組培苗滲透調節物質積累的影響[J]. 西北植物學報，2005，25（12）：2484-2489.

[9] FAN Jun-feng ， LI Ling， HAN Yi-fan， LI Jia-rui. Establishment of leaf regeneration system in Kiwifruit （‘Qinmei）[J]. Acta Boreal.-Occident. Sin. 2002， 22（4）：907-912.

樊軍鋒，李 玲，韓一凡，李嘉瑞. 秦美獼猴桃葉片最佳再生系統的建立[J]. 西北植物學報， 2002，22（4）： 907-912.

[10] ZHENG Ya-jie， YAO Huan-yu. Studies on tissue culture technology of GM256， a dwarf rootstock of apple[J]. Journal of Jilin Agricultural Sciences， 2008， 33（1）： 26-27，32.

鄭亞杰，姚環宇. 蘋果矮化砧GM256組織培養與快繁技術研究[J]. 吉林農業科學， 2008，33（1）： 26-27，32.

[11] ZHANG Qing-tian. Several kind of apples stocks tissue culture technology research[D]. Taian： Shandong Agriculture University， 2007.

張慶田. 幾種蘋果砧木組織培養技術的研究[D]. 泰安： 山東農業大學，2007.

[12] LU Shi-peng. Effectts of water stress on the growth and physiological properties of zizyphus jujube seedings[D]. Gui Yang： Guizhou University， 2006.

劉世鵬. 水分脅迫對棗樹苗期生長及生理特性的影響[D]. 貴陽：貴州大學，2006.

[13] SUN Qun， HU Jing-jiang. Plant physiology research and technology[M]. Northwest A&F; University Press，2006.

孫群，胡景江. 植物生理學研究技術[M]. 西北農林科技大學出版社，2006.

[14] GAO Peng， LIU Zun-chun， LIU Yan-pu. Response and drought resistance of four grape varieties to water stress[J]. Journal of Henan Agricultural Science， 2009（3）： 79-81.

高鵬，劉尊春，劉硯璞. 4個葡萄品種對水分脅迫的響應及其抗旱性評價[J].河南農業科學，2009（3）： 79-81.

[15] LIAO Jing-rong，ZHENG Zhong-yang， ZHANG Wei-xing. Comparing analysis of drought resistance and yield potential in different hybrid maize varieties[J]. Journal of Anhui Agri Sci，2005， 33（1）： 7-10.

廖景容，鄭中陽，張衛星. 玉米不同雜交組合抗旱性、豐產性的研究[J]. 安徽農業科學， 2005，33（1）7-10.

[16] XU Qi-he. Physiological responses of apple rootstocks to drought stress and evaluation of drought resistance[D]. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2010.

徐啟賀. 蘋果砧木對干旱脅迫的生理響應及抗旱性評價[D]. 北京：中國農業科學院，2010.

[17] ZHENG Hai-yan， WANG Yan-ling， LIAO Kang， GUO Xian-ping， WANG Jin， ZHAO Lei. Effect of soil drought stress osmotic adjustment substances of prunnus of divaricata leaves[J]. Jouranl of Xinjiang Agricultural University， 2009， 32（1）： 47-51.

鄭海燕，王燕凌，廖康，郭獻平，王瑾，趙蕾.土壤干旱脅迫對野生櫻桃李葉片滲透調節物質的影響[J]. 新疆農業大學學報，2009，32（1）： 47-51.

[18] YONG Shi-quan， TONG Chuan， ZHUANG Chen-hui， YANG Wei-ping， LI Xu-wei， ZHANG Lin-hai， HUANG Jia-fang. Effects of cold weather on seedlings of three mangrove species planted in the Min River estuary during the 2010 winter[J]. Acta Ecologica Sinica， 2011， 31（24）： 7542-7550.

雍石泉，仝川，莊晨輝，楊渭平，李旭偉，張林海，黃佳芳. 2010年冬季寒冷天氣對閩江口3種紅樹植物幼苗的影響[J]. 生態學報，2011，31（24）： 7542-7550.

[19] HU Xiu-li， ZHANG An-ying， ZHANG Jian-hua， JIANG Ming-yi. Abscisic acid is a key inducer of hydrogen peroxide production in leaves of maize plants exposed to water stress[J]. Plant Cell Physiology， 2006， 47（11）： 1484-1495.

[20] ZHENG Wen-jiao， LIN Peng， ZHENG Feng-zhong， LU Chang-yi. The physiological characteristics of salt tolerance for Kandelia candel seedlings[J]. Journal of Xiamen University： Natural Scienc，1993， 32（4）： 113-118.

[21] LI Xia， YAN Xiu-feng， YU Tao. Effects of water stress on protective enzyme activities and lipid peroxidation in Phellodendron amurense seedlings[J]. Chines Journal of Appliedecology， 2005， 16（12）： 2353 -2356.

李霞，閻秀峰，于濤. 水分脅迫對黃檗幼苗保護酶活性及脂質過氧化作用的影響[J]. 應用生態學報，2005，16（12）： 2353 -2356..

[22] MA Shuang-yan， JIANG Yuan-mao， PENG Fu-tian， SUN Jian-yi. Effect of drought stress on betaine MDA and proline content in apple leaves[J]. Deciduous Fruits， 2003（5）： 1-4.

馬雙艷，姜遠茂，彭福田，孫建義. 干旱脅迫對蘋果葉片中甜菜堿和丙二醛及脯氨酸含量的影響[J]. 落葉果樹，2003（5）： 1-4.

[23] TAN Dong-mei. The physiology and biochemistry of programmed Malus siversii and M. hupehensis cell death under drought stress[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2007， 40（5）： 980-986.

譚冬梅.干旱脅迫對新疆野蘋果及平邑甜茶生理生化特性的影響[J]. 中國農業科學，2007，40（5）： 980-986.

[24] YAN Fen-fen. Research on responses of apple dwarf rootstocks to water stress[D]. Bao Ding： Agriculture University of Hebei，2010.

閆芬芬. 蘋果矮化砧木對水分脅迫的響應研究[D]. 保定： 河北農業大學， 2010.