楊桃遺傳多樣性的形態特征與RAPD標記的相關性分析

劉鍇棟　袁長春　黎海利　陳春華　譚雪瓊

摘 要： 【目的】為指導楊桃種質資源的引進以及良種選育提供科學依據，【方法】采用形態標記數量聚類分析和RAPD分子標記相結合，對廣東地區10份楊桃品種資源進行遺傳多樣性分析，并將形態學聚類和RAPD分子標記聚類結果加以對比。【結果】在所觀察的12個形態性狀中，變異系數為14.08%～49.71%，平均變異系數為25.38%。從100條RAPD隨機引物中篩選出10個引物，共擴增出58條帶，其中53條為多態性帶，多態率達93.02%。聚類分析結果表明，形態標記和RAPD標記都可依果實風味將供試材料分組，即甜味和酸味。2種標記方法的相關系數為r0.01=0.685 3，達到顯著水平。【結論】楊桃具有豐富的遺傳多樣性，2種方法聚類結果相似，且相關性高，具有較高的可靠性。

關鍵詞： 楊桃； 形態性狀； RAPD； 聚類分析

中圖分類號：S667.9 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0069-06

楊桃（Averrhoa carambola L.）又名五斂子、陽桃、洋桃等，屬酢漿草科（Oxalidaceae）楊桃屬（Averrhoa Linn.）植物。因其橫切面如五角星，故國外又稱之為“星梨”[1]。最早從馬來西亞及越南傳入我國，已有2000多年栽培歷史，是久負盛名的嶺南佳果之一。楊桃果形美，味甜，具有較高的營養價值。既可鮮食，也可加工成多種加工品。葉、果、花、根都可入藥。此外，楊桃生長快，早結豐產，可周年供果，耐旱、耐瘠，適應性強，病蟲害少，經濟效益好，是著名的嶺南佳果之一[2-3]。

廣東省作為楊桃的主要產區，近年來從臺灣、新加坡、馬來西亞、泰國等地引進許多新的品種，并通過嫁接方式培育了不少經濟價值高的品種。隨著引進品種的不斷增多，而當地又有不少地方品種，這就造成楊桃品種繁雜和混亂，且出現了不少同名異種或同種異名現象，給果農選種育苗帶來較大的困難，也對產量造成很大的影響。

目前對于楊桃種質資源遺傳多樣性的研究報道較少，劉韜等[4]對福建省主要楊桃品種遺傳多樣性進行了RAPD分子標記分析，將17份楊桃品種劃分為3 個類群，并得出楊桃品種資源之間具有豐富的多態性，證明了RAPD標記在楊桃遺傳多樣性研究中的可行性。傳統的遺傳多樣性和親緣關系的研究方法除了分子標記還有根據形態特征來進行研究的方法。而分子標記與形態性狀的聚類分析結果各有側重，相互補充[5]。在研究中把分子生物學手段與形態性狀比較鑒定結合起來分析可以避免單一方法對研究結果造成偏差[6-7]，而且結合形態標記和分子標記技術來研究植物種質資源遺傳多樣性和親緣關系已被證實是可行和可靠的[8-9]，但應用這2種技術對楊桃進行遺傳多樣性研究至今未有報道。

因此，筆者利用RAPD技術和形態標記數量聚類分析方法對廣東地區10個主要楊桃品種進行遺傳多樣性分析，并對其進行綜合客觀評價，以期為楊桃種質的鑒定、保存、創新以及嫁接栽培選擇合適的砧木提供科學依據。同時，通過對廣東楊桃品種的遺傳多樣性進行評估，為當地楊桃資源保護、種質資源的引進、新品種選育以及核心種質構建提供參考和科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

材料分別采集于廣東地區湛江、茂名、陽江等地種植的臺灣、泰國、馬來西亞和新加坡等7個引進品種和粵西地區3個本地品種的葉片，具體見表1。

1.2 植物學特征的統計與編碼賦值

楊桃果樹葉性狀在果樹達到生長盛期時調查，在種植地隨機選取5株有代表性的植株，每株隨機選取10枚葉片觀察，數量性狀的記錄數值為5株的平均值；果實性狀的調查在達到商品成熟度時進行；在種植地隨機選取生長正常的楊桃5個，數量性狀的記錄數值為5個果實的平均值。通過對各楊桃品種葉片和果實的形態觀察，分別選取12個性狀進行數量分類研究，并進行編碼賦值。調查的具體性狀和編碼情況見表2。參照郭先鋒等[10]的數量分類學方法對不同品種進行聚類分析，并繪制樹狀圖。

1.3 DNA提取方法及檢測

楊桃總DNA的提取采用改良的2×CTAB法[11]，用紫外分光光度計在260 nm和280 nm下測定OD值，檢測DNA的質量和濃度，并稀釋到30 mg·L-1。

1.4 RAPD標記

從100條隨機引物中篩選出10條條帶清晰、穩定、重復性好、多態性強的引物，并用這10條引物對10份楊桃樣品的總DNA進行擴增。

RAPD-PCR反應體系為25 μL，其中包括： 10×PCR buffer 2.5 μL，20 mmol·L-1 MgCl2 2.5 μL，2 mol·L-1 dNTP 2.5 μL，8 pmol·L-1隨機引物1 μL，2 U Taq酶，30 ng模板DNA。擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共45個循環；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。擴增反應在PCR儀上進行。反應結束后，擴增產物在1×TAE緩沖液中，用1.5%瓊脂糖凝膠（含GoldView I 型核酸染色劑）中以5 V·cm-1的電壓電泳分離。用BioRad凝膠成像系統進行拍照分析。

1.5 數據統計與計算

1.5.1 形態數據統計與計算 形態數據的變異系數計算為性狀標準差/性狀平均值；聚類分析使用“DPS數據處理系統”中的“多元分析—聚類分析”軟件包完成，數據標準化使用“標準差標準化”命令，相似性系數的計算使用“歐式距離系數”，聚類方法采用非加權組平均法（UPGMA）[12]。

1.5.2 RAPD 數據統計與計算 將電泳圖譜清晰且可重復的條帶賦值為1，同一位置上的弱帶且不重復或未出現帶的賦值為0，形成1、0數據矩陣，計算單位引物擴增的條帶、多態性條帶及多態性條帶百分率[13]。根據Nei-Li相似系數法[14]，采用DPS數據處理系統計算出遺傳距離。以遺傳距離為標準，用非加權組平均法（UPGMA）進行聚類分析，生成聚類圖。

1.5.3 形態數據與RAPD數據的比較 利用“DPS數據處理系統”，得到由形態學指標計算生成的歐氏距離矩陣和由電泳條帶賦值計算生成的RAPD遺傳距離矩陣。然后用Mantel test[15]對由形態學指標計算所得的歐氏距離矩陣和RAPD遺傳距離矩陣之間的相關性進行檢測。具體使用TFPGA軟件中的Mantel test模塊檢測。2個矩陣輸入TFPGA軟件包[16]，利用其中的Mantel test模塊檢測2者相關性，顯著性檢驗共進行10 000次隨機運算[15]。

2 結果與分析

2.1 楊桃供試材料的植物學形態數量性狀分析

對10個楊桃品種的7個植物學形態數量性狀的基本數據統計分析結果表明，7個數量性狀的平均變異系數為25.38%，其中以單果質量性狀變化最大，變異系數為49.71%。單果質量最大的是‘秤錘，平均單果質量為402.43 g；單果質量最小的是細花，平均單果質量為81.73 g。葉長寬比性狀差異也較大，最大的是‘細花，為3.12，最小的是‘臺農一號，為1.5。因此，可以從果實質量和葉片長寬比來區分各種質。變異系數最小的是葉面積，為14.08%，也超過了10%。以上結果說明各性狀在不同種質材料之間存在著較大差異以及不同程度的多樣性。

2.2 楊桃供試材料植物學形態性狀聚類分析

對10個楊桃品種的12個植物學形態性狀（包括質量性狀和數量性狀）的基本數據進行統計和聚類分析，結果如圖1。當λ=5.31時，10個楊桃品種分為兩大類，本地酸楊桃品種‘細花、‘新橋和‘麻章二號聚為一類，其余外來引進品種聚為一類。當λ=3.18時，可將供試品種分為5類，‘臺灣紅楊桃和‘秤錘2個品種聚為一類，這2個品種均來自臺灣，都表現出單果質量量大、汁多味甜、葉卵形和葉長較短等特點；‘泰國楊桃和‘馬來西亞B17歸為一類，2個品種均表現出葉長和葉寬較大、果實較長和單果質量量較大等特點；‘蜜絲、‘臺農1號和‘新加坡楊桃為一類；‘細花單獨為一類；‘新橋和‘麻章二號聚為一類。‘新橋和‘麻章二號這2個粵西本地品種均表現出果實味道較酸、葉較長、單果質量量較小等特點。由以上結果可以看出，基于楊桃形態性狀的聚類結果能較好地反映種質間的親緣關系和形態相似性。

2.3 RAPD引物篩選及多態性分析

通過對10份楊桃種質資源的總DNA進行PCR擴增，10條隨機引物共擴增出58條可區分的、重復性高的DNA條帶。統計結果顯示，共有檢出位點58個，不同的隨機引物擴增結果各不相同，其中單態位點5個，多態位點53個，多態率達93.02%。G9引物的擴增位點最多，為9個擴增位點。平均每個引物擴增出條帶5.8條。這說明RAPD擴增出來的楊桃DNA片段多態性比較豐富，同時也表明這10份楊桃樣品在分子水平上存在明顯的差異。

2.4 楊桃供試材料RAPD分子標記聚類分析

基于遺傳距離進行聚類分析所得的樹狀圖見圖2。10份楊桃遺傳距離為0.16129～0.53146。當λ=0.48時，10份楊桃可以劃分為3個類群：第I類群包括‘臺灣紅楊桃、‘秤錘、‘馬來西亞B17、‘臺農1號、‘蜜絲、‘新加坡楊桃、‘泰國楊桃；第II類群包含‘新橋和‘麻章二號2個本地品種；第III類群包括‘細花。根據楊桃風味可以劃分為甜楊桃和酸楊桃兩大類，聚類分析結果表明，第I類群的楊桃品種基本都屬于甜楊桃品種，且都是外來引進品種，來自臺灣的‘臺灣紅楊桃、‘秤錘、‘臺農1號和‘蜜絲這4個品種聚為一起，遺傳距離較近；第II、III類群中的楊桃品種都是廣東粵西地區的酸楊桃品種。

2.5 楊桃供試材料RAPD標記與形態學之間的相關分析

利用TFPGA軟件中的Mantel test模塊檢測對由基于形態標記計算的遺傳距離矩陣和由RAPD標記計算的遺傳距離矩陣作相關分析，分析2個距離矩陣數值（圖3），得出兩個矩陣的相關系數為r0.01=0.685 3，達到顯著水平，表明RAPD分子標記與形態標記所反映的品種間的遺傳多樣性有較高的一致性和可信度。因此將兩標記結合起來可以較好地揭示楊桃種質的遺傳多樣性。

3 討 論

3.1 廣東地區主要楊桃品種具有豐富的遺傳多樣性

近年來，廣東省大力發展楊桃生產，從臺灣、泰國、馬來西亞和新加坡等地引進了不少優良品種，使得廣東楊桃種質資源類型不斷豐富。但是由于頻繁引種，也使得廣東地區楊桃種質資源較為混亂，因此分析它們之間的遺傳差異有助于指導種質資源的引進和品種遺傳改良，提高品質和產量。

植物性狀遺傳多樣性的數量化表現主要集中在性狀的變異頻率，其中變異系數越大，就說明樣本間的差異越大，可以在優異種質資源中有更大的選擇余地[17-18]。一般認為變異系數大于10%就說明樣本間的差異較大。本文對10個楊桃品種的形態性狀分析結果表明，各性狀之間的變異系數為14.08%～49.71%，平均變異系數為25.23%，葉長7.03～10.71 cm，葉寬3.12～5.34 cm，葉面積23.69～38.23 cm2，葉長寬比1.34～3.12，果長7.50～12.20 cm，單果質量81.73～402.43 g，整株果質量45.23～129.76 kg。各個性狀的變異系數均高于10%，說明各材料之間存在較大差異。RAPD擴增條帶中，多態性達到93.02%，可見楊桃種質資源在分子水平上存在遺傳差異。綜合分析，楊桃資源具有較為豐富的遺傳多樣性和遺傳背景的復雜性，存在較大的遺傳變異和選擇潛力，這與劉韜等[4]的研究結果較為一致。

從楊桃的RAPD分析結果可知，‘馬來西亞B17、‘臺農1號、‘秤錘都聚為一類，特別是‘馬來西亞B17和‘臺農1號緊密聚在一起，這與劉韜等[4]的研究結果完全一致。但是有所不同的是，本研究中的‘泰國楊桃是和‘馬來西亞B17、‘臺農1號、‘秤錘等都聚為一類的，而劉韜等[4]的研究結果顯示泰國種在聚類分析處于不同的類群，這可能是因為兩個研究中‘泰國楊桃可能存在同名不同種的現象，有待進一步分析探討。本研究RAPD聚類分析中第I類群的楊桃品種基本都屬于甜楊桃品種，且都是外來引進品種，劉韜等[4]的RAPD聚類分析研究結果也顯示第I類群的楊桃品種全為外來引進品種。這說明，由分子標記RAPD技術分析反映得出的親緣關系遠近和遺傳多樣性的情況可以得到重復性、可靠性的試驗結果。RAPD技術只要材料選擇合適、反應條件控制嚴格、分析數據詳實合理，就完全可以應用在楊桃品種親緣關系分析過程中。

3.2 形態標記和RAPD分子標記結合分析具有一定的可靠性

在植物學性狀的比較分析中，形態學方法是最古老的物種鑒定方法，它具有直觀、標記簡便、容易獲得等特點，目前仍是植物遺傳多樣性研究的主要方法[19]。本研究基于形態標記的聚類分析結果將廣東地區楊桃主要品種劃分為兩大類，各類之間的形態差異較明顯。但由于表型是環境和基因型互作的結果，受環境影響較大，有些表型的變化并不是可遺傳的變異，因此單從形態學上研究遺傳多樣性具有一定的局限性[20]。部分研究結果也表明，形態性狀的差異不一定能反映遺傳上的差異，形態性狀的相似也不一定意味著遺傳關系的近緣[21]。近年來， 一些分子標記方法逐步引入了植物的遺傳多樣性分析，劉韜等[4]對福建省主要楊桃品種遺傳多樣性進行了RAPD分子標記分析，將17份楊桃品種劃分為3個類群，多態率達97.19%，證實了RAPD 技術可以準確偵測到種間的遺傳多態性。因此，有必要結合形態學和RAPD標記技術對楊桃品種遺傳多樣性進行更系統、更全面的分析。

本研究認為，無論是形態學標記還是RAPD分子標記的結果都可以把楊桃分為甜楊桃和酸楊桃，這與傳統的分類方法基本相符。這說明利用2種標記對楊桃種質進行區分和鑒定都是行之有效的。利用Mantel test[15]對由形態學指標計算所得的歐氏距離矩陣和RAPD遺傳距離矩陣之間的相關性進行檢測，得出由2種技術得出矩陣的相關系數為0.685 3（P<0.01），達到顯著水平，這說明形態標記和RAPD標記匹配良好。且實驗結果表明形態標記對楊桃種質分類有一定的可信度，RAPD分子標記可將種質間的遺傳差異進一步表現出來。同時2種方法都基本可將楊桃品種按照種質來源明顯的區分開來。3個來自廣東粵西地區的本地品種都聚為一類，來自臺灣地區的‘臺灣紅楊桃、‘秤錘、‘臺農1號和‘蜜絲4個品種在RAPD標記聚類分析中能聚在一起。因此，在楊桃遺傳多樣性研究和育種實踐中，可以以分子標記為基礎，與形態性狀充分結合，展開分析，提高選種、育種工作的實際效率。

參考文獻 References：

[1] ZENG Jian-fei， YAO Jian-yi. Rosaceae. In： flora reipublicae popularis sinicae（Vol. 43，1）[M]. Beijing： Science Press， 1998： 4-20.

曾建飛， 姚堅毅. 中國植物志（第四十三卷，第一分冊）[M]. 北京： 科學出版社， 1998，4-20.

[2] QIAN Ai-ping. Analysis of amino acid composition and evaluation of nutritional quality in Carambola[J]. Food and Nutrition in China， 2012，18（4）：75-78.

錢愛萍. 楊桃的氨基酸組成及其營養價值評價[J]. 中國食物與營養， 2012，18（4）： 75-78.

[3] LIU Sheng-hui， WEI Chang-bin， LI Wei-cai， ZANG Xiao-ping. Analysis of the aromatic constituents in 3 starfruit cultivar[J]. Journal of Fruit Science， 2008， 25（1）： 119-121.

劉勝輝，魏長賓， 李偉才， 臧小平. 3個楊桃品種的果實香氣成分分析[J]. 果樹學報， 2008， 25（1）： 119-121.

[4] LIU Tao， CHE Jian-mei， HUANG Su-fang， LIAO Ru-yu， LIU Bo. RAPD analysis of genetic diversity of carambola in Fujian province[J]. Journal of Fruit Science， 2011， 28（3）： 448-452.

劉韜， 車建美， 黃素芳， 廖汝玉， 劉波. 福建省主要楊桃品種遺傳多樣性分析[J]. 果樹學報， 2011， 28（3）： 448-452.

[5] LIU Meng-juan， HU Sheng-wu， ZHAO Hui-xian， ZHANG Min. Genetic diversity of Shanxi Soybean landraces based on agronomic traits and RAPD data[J]. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica， 2009， 18（5）： 159-166.

劉萌娟， 胡勝武， 趙惠賢， 張敏. 基于農藝性狀和RAPD片段的陜西大豆種質資源遺傳多樣性研究[J]. 西北農業學報， 2009， 18（5）： 159-166.

[6] ZHANG Lu， YANG Ruo-lin， LIU Wen-xuan， DENG Zhi-rui， CHEN Qin. Genetic similarities among some cultivars of Capsicum Frutescens L. revealed by RAPD[J]. Journal of Shanhai University（Natural Science）， 2003， 9（5）： 433-444.

張璐， 楊若林， 劉文軒， 鄧志瑞， 陳沁. 辣椒部分栽培種遺傳相似性的RAPD分析[J]. 上海大學學報， 2003， 9（5）： 433-444.

[7] LING Yao， ZHANG Xin-quan， CHEN Shi-yong， LIU Wei， MA Xiao. Genetic diversity of Cynodon Dactylon germplasm by SRAP and SSR markers[J]. Scientia Agricultura Sinica，2012，45（10）：2040 -2051.

凌瑤， 張新全， 陳仕勇， 劉偉， 馬嘯. 野生狗牙根種質資源SRAP 與SSR 的遺傳多樣性[J]. 中國農業科學， 2012， 45（10）： 2040-2051.

[8] WANG Jiao， LIU Chong-huai， FAN Xiu-cai， SUN Hai-sheng， DONG Dan. Study on the biodiversity of the morphology and polymorphism based on SSR marker s for Vitis ficifolia native to Henan province in China[J]. Journal of Fruit Science， 2008， 25（4）： 496-500.

王姣， 劉崇懷， 樊秀彩， 孫海生， 董丹. 河南境內桑葉葡萄種內形態和遺傳多樣性分析[J]. 果樹學報， 2008， 25（4）： 496-500.

[9] LUO Ying， WU Li-dong， ZENG Shao-gui， ZHU Bang-tong， XU Xu-ming， WEN Qing-fang. Comparative study on the relationships of Pepper in bred lines based on RAPD markers and morphological clustering[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2011， 27（16）： 136-141.

羅英， 吳立東， 曾紹貴， 朱邦彤， 許旭明， 溫慶放. 基于RAPD標記與形態標記的辣椒自交系間親緣關系的比較研究[J]. 中國農學通報，2011， 27（16）： 136-141.

[10] GUO Xian-feng， WANG Lian-ying. Study on numerical taxonomy of Chinese cultivated Herbaceous Peonies and its related wild species[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2005， 32（3）： 473-476.

郭先鋒， 王蓮英. 我國栽培芍藥與幾個近緣種的數量分類學研究[J]. 園藝學報， 2005， 32（3）： 473-476.

[11] SHI Su-hua， ZHANG Qun， CHEN Yue-qin， TANG Shao-qing， QU Liang-hu. A simple method for isolation of total RNA and DNA from silicagel-dried and fresh leaves of plants[J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni， 1996， 35（2）： 103-105.

施蘇華， 章群， 陳月琴， 唐紹清， 屈良鵠. 一種簡易的植物核酸提取方法—從干葉和鮮葉中快速提取RNA和DNA[J]. 中山大學學報： 自然科學版， 1996， 35（2）： 103-105.

[12] VIERLING R A， NGUYEN H T. Use of RAPD markers to determine the genetic diversity of diploid， wheat genotypes[J]. Theor Appl Genet， 1992，84：835-838.

[13] LI Xi-xiang， ZHU De-wei， DU Yong-chen， ZHANG Guang-ping， SHEN Di. Genetic diversity and phylogenetic relationship of Cucumber（Cucumis sativus L.） germplasm based on RAPD analysis[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2004， 5（2）： 147-152.

李錫香，朱德蔚，杜永臣， 張廣平， 沈鏑. 黃瓜種質資源遺傳多樣性的RAPD鑒定與分類研究[J]. 植物遺傳資源學報，2004，5（2）： 147-152.

[14] NEI M， LI W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. PNAS， 1979，76： 5269-5273.

[15] MANTEL N A. The detection of disease clustering and a generalized regress ion approach[J]. Cancer Research， 1967， 27： 209-220.

[16] BONNET E， VAN de Peer Y. zt：a software tool for simple and partial Mantel tests[J]. Joumal of Statistical Software， 2002， 7（10）： 1-12.

[17] WANG Li-rong， ZHU Geng-rui， FANG Wei-chao. The evaluating criteria of some fruit quantitative characters of Peach （Prunus persica L.） genetic resources[J]. Acta Horticulturae Sinica，2005，32 （1）： 1-5.

王力榮， 朱更瑞， 方偉超. 桃（Prunus persica L. ）種質資源果實數量性狀評價指標探討[J]. 園藝學報， 2005， 32（1）： 1-5.

[18] AN Wei， ZHAO Jian-hua， SHI Zhi-gang， JIAO En-ning. Evaluation criteria of some fruit quantitative characteristics of wolfberry（Lycium） genetic resources[J]. Journal of Fruit Science， 2007， 24（2）： 172-175.

安巍， 趙建華， 石志剛， 焦恩寧. 枸杞種質資源果實數量性狀評價指標探討[J]. 果樹學報， 2007， 24（2）： 172-175.

[19] HE Xiao-xia， LIU Yi-ming， WANG Zhao-long. Morphological characteristics and AFLP analysis in Seashore Paspalum （Paspalum vaginatum） varieties[J]. Acta Agrestia Sinica，2011，19（1）： 164-170.

賀小霞， 劉一明， 王兆龍. 海濱雀稗栽培品種的形態特征與AFLP分子標記分析[J]. 草地學報， 2011， 19（1）： 164-170.

[20] SUN Qun， TONG Han-wen， WU Bo， DING Zi-mian， WANG Jian-hua， SUN Bao-qi. Genetic diversity of Glycyrrhiza uralensis Fisch. detected by morphological and ISSR molecular markers[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2007， 8（1）： 56-63.

孫群， 佟漢文， 吳波， 丁自勉， 王建華， 孫寶啟. 不同種源烏拉爾甘草形態和ISSR遺傳多樣性研究[J]. 植物遺傳資源學報， 2007， 8（1）： 56-63.

[21] WEN Yan-cheng， WANG Han-zhong， SHEN Jin-xiong， LIU Gui-hua， ZHANG Shu-fen. Analysis of genetic diversity and genetic basis of Chinese rapeseed cultivars （Brassica napus L.） by sequence-related amplified polymorphism markers[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2006， 39（2）： 246 -256.

文雁成， 王漢中， 沈金雄， 劉貴華， 張書芬. 用SRAP標記分析中國甘藍型油菜品種的遺傳多樣性和遺傳基礎[J]. 中國農業科學， 2006， 39（2）： 246-256.