五葉草莓超低溫保存及遺傳穩定性分析

朱文濤　周厚成　王子成

摘 要：【目的】為了找出野生種質資源五葉草莓（Fragaria pentapylla）的超低溫保存方法和分析超低溫保存后五葉草莓的遺傳信息穩定性，【方法】運用玻璃化法對五葉草莓離體莖尖超低溫保存技術進行了研究，并采用AFLP和MSAP技術對其遺傳穩定性作了探討。【結果】結果表明，不同的低溫鍛煉時間、預培養時間、預處理時間、玻璃化溶液（PVS2）處理時間和液氮保存時間對五葉草莓超低溫保存后成活率的影響各不相同，經優化后，低溫鍛煉3周，預培養3 d，預處理30 min，PVS2處理60 min時，超低溫保存的最高成活率可達79.7%，液氮處理時間對成活率影響不明顯；運用AFLP技術對超低溫后成活生長120 d的材料及對照材料基因組DNA進行了分析，超低溫前后帶型一致，未發現明顯差異片段；進一步用MSAP技術分析了超低溫保存后成活的材料和對照材料DNA甲基化水平差異，結果表明超低溫保存后五葉草莓DNA甲基化與去甲基化分別為5.70%和12.43%。【結論】玻璃化法超低溫保存技術可以有效的保存五葉草莓種質資源，超低保存前后的五葉草莓基因組DNA沒有發生多態性變化，但DNA甲基化水平降低。

關鍵詞： 五葉草莓； 超低溫保存； 玻璃化法； 遺傳穩定性； 甲基化

中圖分類號：S668.4 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0055-07

栽培種鳳梨草莓（Fragaria ananassa Duch.）是一種營養價值與經濟價值較高的園藝作物，目前被視為一種經濟植物而被廣泛栽培[1]。由于野生草莓具有廣泛的適應性和多種優良特性，例如：風味品質、抗病、抗蟲和抗不良環境脅迫等，通常作為栽培種草莓改良的重要材料[1-3]。五葉草莓（Fragaria pentapylla），也叫泡兒，秧泡兒，原產我國，是我國豐富的野生草莓資源的一種[4]，它具有抗寒、抗病性強、果實香味濃等特點，是進行栽培種培育和改良的理想親本。同時，五葉草莓屬于二倍體草莓，染色體數目少[5]，基因組小得多，使其成為薔薇科植物基因功能研究中有應用潛力的良好材料。五葉草莓以及野生草莓都是寶貴的野生資源，然而目前沒有一種有效的手段使其種質資源得到長期保存。

上世紀70—80年代建立起的超低溫保存技術對種質資源保存具有重要的意義[6-7]。超低溫保存技術是將植物材料保存在-80 ℃及其以下，使細胞內的物質代謝與生長活動近乎停止，處于“生機停頓”（suspended animation）狀態，從而實現植物材料的長期保存。目前，進行超低溫保存的方法有多種[6-7]，主要是玻璃化法、包埋干燥法、包埋玻璃化法、小滴玻璃化法等。然而，植物在超低溫保存過程中，會涉及到一系列的脅迫[8]，這些脅迫有可能對其遺傳的穩定性產生一定的影響。近年來，許多學者就超低溫保存后再生材料的遺傳穩定性問題做了大量的研究和分析，主要集中在：（1）超低溫保存材料的基因組遺傳穩定性研究；（2）超低溫保存再生材料的表觀遺傳信息變異情況分析等方面[8]。在基因組穩定性方面，許多學者運用了AFLP[9]、RAPD等多種技術對材料的基因組進行了分析，袋鼠花（Anigozanthos viridis）[10]、蘋果[11]、擬南芥[12]、椰子（Cocos nucifera L.）[13]等大部分研究都證明了超低溫之后基因組沒有發生改變，但是在冷杉[14]、木瓜[14-15]等少數研究中卻發現其基因組改變的現象。對超低溫保存中的DNA甲基化變化的研究中，發現蘋果[10]、木瓜[15]、蛇麻草（Humulus lupulus）[16]、擬南芥[17]、虎耳草科酷栗屬[18]等不同基因型的植物材料經過超低溫保存后甲基化水平均發生了不同程度的變化。我們采用玻璃化法對五葉草莓進行了超低溫保存，運用AFLP技術對超低溫保存前后五葉草莓材料的基因組信息進行分析，以確定五葉草莓材料超低溫保存后基因組遺傳穩定性是否良好，同時運用MSAP技術對超低溫前后的五葉草莓的DNA甲基化水平進行分析，探討五葉草莓超低溫前后的甲基化水平變化以及變化趨勢，以期為完善超低溫保存后五葉草莓的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

以河南大學植物種質資源及遺傳實驗室提供的五葉草莓 （F. pentapylla） 幼苗為實驗材料，五葉草莓采自秦嶺地區。

1.2實驗方法

1.2.1 組織培養體系的建立 自田間選取五葉草莓健壯的匍匐莖，取1.5～3.0 cm長的頂芽，采用常規方法進行清洗和消毒，選用MS+6-BA 1.0 mg·L-1 +IBA 0.1 mg·L-1作為五葉草莓誘導培養基，MS+6-BA 0.5 mg·L-1 +IBA 0.1 mg·L-1作為繼代培養基，培養出大量的五葉草莓組培苗。

1.2.2 超低溫保存過程 采用的超低溫方法為玻璃化法[17，19]，該方法在前人的基礎上加以改良，其具體的操作流程為：首先，將繼代培養25 d的試管苗置于4 ℃冰箱低溫鍛煉，并設置時間梯度為0、1、2、3、4、5周，記錄植株生長情況；其次，取低溫鍛煉后的試管苗，在無菌條件下切取莖尖約5 mm，將其置于預培養培養基（MS +0.4 mol·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂，pH=5.8）中4 ℃預培養，培養時間為0、1、2、3、4 d；然后，將莖尖轉入加有液體預處理培養基的無菌冷凍管中20 ℃預處理，每管15個莖尖，預處理時間0、10、20、30、40 min；然后用無菌膠頭滴管吸出預處理液，加入玻璃化溶液PVS2（MS+30%（w/v）甘油+15%（w/v）乙二醇+15%（w/v）DMSO+0.4 mol·L-1）0 ℃處理0、20、40、60、100 min；接下來，將冷凍管放入紗布袋并迅速投入液氮中保存1、7、14 d；最后，將材料快速取出，42 ℃水浴化凍處理2～3 min，在超凈工作臺下吸去冷凍保護液，用含有1.0 mol·L-1蔗糖的MS洗滌液將莖尖洗滌3次，每次10 min，并接種到恢復培養基上進行培養（培養條件：溫度 （24±1）℃，光照12 h·d-1），21～25 d統計數量并計算成活率。

試驗重復3次，求平均成活率。計算公式為：

成活率（%）=（玻璃化超低溫保存后成活的莖尖數/保存的總莖尖數）×100

1.2.3 五葉草莓超低溫保存前后AFLP分析 采用改良的CTAB法[20]提取五葉草莓總DNA， -20 ℃保存備用。AFLP分子標記技術的實驗程序主要參照Turner等[10]和郝玉金等[11]的AFLP程序，引物設計如表1。AFLP分子標記技術主要包括以下幾個過程：選用限制性內切酶EcoRI/MseI對目的基因組DNA進行雙酶切、連接、預擴增、選擇性擴增、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染檢測。

1.2.4 超低溫前后五葉草莓DNA甲基化變化MSAP分析 利用MSAP技術分析基因組的DNA甲基化變化，此方法主要參照Cervera等[21]與何艷霞等[17]的方法，引物設計如表1。該方法在AFLP的基礎上用對甲基化敏感的MspⅠ和HapⅡ代替AFLP分子標記中的高頻酶MseⅠ，然后用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ的組合對目的DNA進行酶切，酶切產物隨后進行連接、預擴增、選擇性擴增、電泳及銀染，其操作過程和程序與上述AFLP分析的操作一致。

2 結果與分析

2.1 超低溫保存結果與分析

2.1.1 低溫鍛煉對超低溫保存后莖尖成活率的影響

對五葉草莓低溫鍛煉時間不同，其超低溫保存后成活率也會受到不同程度的影響，低溫鍛煉能明顯影響保存后莖尖存活率。如圖1所示鍛煉21 d時存活率為最高值51.9%，隨著鍛煉時間的延長，成活率出現下降趨勢。在低溫鍛煉期間觀察發現經過28 d后試管苗葉片逐漸變成黃褐色，保存后再生材料存活率也有所下降。

2.1.2 固體預培養對超低溫保存成活率的影響 用固體預培養培養基對五葉草處理的時間不同，則超低溫保存后成活率的影響也不同。固體預培養能明顯影響保存后莖尖存活率，如圖2所示固體預培養時間為3 d時存活率為61.5%。低溫鍛煉3周的苗在只改變固體預培養時間的條件下，其他條件限定在液體處理時間20 min，pvs2處理時間60 min，超低溫處理時間1 d，固體預培養為3 d。

2.1.3 液體處理培養基對超低溫保存成活率的影響

對五葉草莓液體進行不同時間的處理，則其超低溫保存后成活率影響也不同，液體處理時間能明顯影響保存后莖尖存活率。液體預處理隨著時間的增加，成活率表現為先增加后減小的趨勢，在處理30 min時成活率最高，達到79.7%（圖3）。

2.1.4 PVS2處理對超低溫保存成活率的影響 超低溫玻璃化過程是對保存起著至關重要的作用，冰凍保護劑PVS2處理使莖尖內組織進一步脫水則是玻璃化過程中極為關鍵的一步。結果表明（圖4）PVS2處理60 min時的莖尖成活率為79.7%，達到最高，時間過短或更長都不利于莖尖的成活和再生。這很可能是由于時間過短導致的玻璃化不完全，從而在凍存過程中植物莖尖受到損傷。當處理時間高于60 min時，由于PVS2本身對材料有毒害作用，進而導致莖尖存活率下降。

2.2 超低溫前后的AFLP分析結果

應用AFLP技術對超低溫保存前后的五葉草莓材料進行檢測分析，14對引物共擴增出可統計條帶526條，部分條帶如圖5所示，在超低溫保存前后的五葉草莓材料之間沒有出現多態性位點。說明對照與超低溫處理樣品之間基因組序列保持一致，沒有發生該方法可以檢測到的遺傳變異。

2.3 超低溫前后的MSAP分析

HpaⅡ和MspⅠ是一組均識別并切割5CCGG 3 序列的同裂酶，HpaⅡ對胞嘧啶的甲基化極其敏感，它不能切割任何一個或兩個均甲基化的序列，能夠識別切割單鏈發生甲基化。MspⅠ對內部胞嘧啶的甲基化是不敏感的，對外部胞嘧啶的甲基化則很敏感。因此，超低溫處理和對照五葉草莓材料提取的DNA經HpaⅡ/EcoRⅠ（H）和MspⅠ/EcoRⅠ（M）酶切后的產物通常有4種甲基化類型，但是，在聚丙烯酰胺凝膠電泳分析膠上只能檢測出3種甲基化類型（圖6）。其中，類型Ⅰ表明CCGG位點沒有發生甲基化變化，類型Ⅱ表明CCGG位點發生了半甲基化，類型III表明CCGG位點發生了全甲基化。為了檢測五葉草莓經過超低溫處理后DNA甲基化的模式，利用不同的引物組合（表1）對超低溫處理樣品及對照組的基因組DNA進行MSAP分析。由表2可知，經超低溫處理后五葉草莓全基因組DNA胞嘧啶甲基化水平降低，且全甲基化率高于半甲基化率。

本實驗一共利用12種不同引物組合對五葉草莓超低溫保存前后的DNA雙酶切產物進行選擇性擴增，并對擴增結果進行分析，發現擴增結果共出現12種帶型（表3），這些帶型又分為多態性和單態性2種。多態性又有3種狀態即甲基化（A型）、去甲基化（B型）以及不定類型（C型），表明CCGG位點甲基化狀態在超低溫處理之后發生不同的改變。A型中的A1和A2為重新甲基化（對照H和M泳道均有條帶，而處理僅H或M泳道有條帶），A3和A4為超甲基化（對照僅H或M有一條帶，而處理H和M泳道均無帶）。A型表明超低溫處理誘導五葉草莓基因組DNA發生了甲基化水平增加的變化；B型含B1、B2、B3和B4，為去甲基化類型，甲基化狀態與A型相反，表明超低溫處理后基因組DNA發生了甲基化水平下降的變化；C型為不定類型，對照組與處理組中DNA甲基化程度的差異無法確定。單態性即對照與處理之間有相同的帶型 （D型），表明低溫處理后CCGG位點的甲基化狀態沒發生變化。其中，D1型為未甲基化，D2和D3為半甲基化。處理與對照的甲基化模式帶型A、B、C和D及相應的位點數見表3。

由表4可知，超低溫處理的五葉草莓基因組DNA甲基化（A型）位點數為11，占總甲基化多態性擴增位點數的5.70%；去甲基化（B型）位點數為24，占總甲基化多態性擴增位點數的12.43%。與對照相比，超低溫處理后的總甲基化多態性為19.17%，甲基化狀態未發生變化（D型）的比率為80.83%。

由此推測，經超低溫處理后五葉草莓基因組DNA的甲基化與對照相比發生了變化，總甲基化比率降低；在擴增的甲基化位點中，去甲基化的位點數高于發生甲基化的位點數，同時基因組DNA甲基化多態性也隨之增加。

3 討 論

研究首次利用玻璃化法對五葉草莓材料進行了超低溫保存試驗，經研究發現：低溫鍛煉3周，能明顯提高五葉草莓莖尖超低溫保存的存活率；固體預培養基中加入甘油對五葉草莓的成活率影響非常大，去除甘油后五葉草莓的成活率明顯提高，固體預培養3 d，能明顯提高成活率；液體預處理時間為30 min時，對五葉草莓的超低溫保存最為有利； PVS2處理是超低溫保存過程中的關鍵步驟，缺少或處理時間不當對保存后莖尖成活率存在顯著影響。試驗中發現，PVS2處理時間并不是越長越好，當處理時間為60 min時存活率達到最高。同時發現，液氮凍存時間對超低溫保存五葉草莓的存活率并無顯著影響，成活率并未產生太大變化，郝玉金等[11]、李俊慧等[19]的研究相符，說明超低溫保存技術可以作為五葉草莓種質資源保存的可靠技術。

AFLP技術是檢測DNA多態性常用的技術，本實驗采用14對引物共擴增出可統計條帶526條帶，沒有出現多態性位點，說明對照與超低溫處理樣品之間基因組序列保持一致，這與Turner等[10]、郝玉金等[11]的研究結果相似，說明玻璃化法超低溫保存技術可以作為五葉草莓種質資源保存的有效手段。

MSAP技術是分析基因組甲基化多態性的一項常規技術，本實驗數據顯示，超低溫處理對五葉草莓的甲基化有一定程度的影響，與對照相比，甲基化水平發生了變化，DNA甲基化位點數占總甲基化多態性擴增位點數的5.70%；去甲基化位點數占總甲基化多態性擴增位點數的12.43%。結果表明玻璃化法超低溫保存成活的五葉草莓甲基化水平降低了6.73%，這與木瓜[15]、蛇麻草（Humuluslupulus）[16]、擬南芥[17]等植物超低溫保存后的甲基化變化趨勢相類似。這種變化趨勢可能是植物對超低溫保存這種逆境處理的一種遺傳適應，其內在機制目前未明，需要進一步的深入探討。

4 結 論

玻璃化法超低溫技術作為一種有效的植物種質資源超低溫保存方法，可以用于五葉草莓種質資源的保存，這樣不僅使其保存后的成活率達到了一個比較高的水平，且超低保存前后五葉草莓基因組DNA多態性并無發生變化。但是研究表明超低保存前后的五葉草莓基因組DNA甲基化水平發生了一定的變化，因此我們需要深入研究甲基化水平的變化對五葉草莓在生理生化方面帶來的影響。

參考文獻 References：

[1] QIN Yong-hua， ZHANG Shang-long. Recent advances in strawberry tiansgenic research[J]. Hereditas， 2007， 29（2）： 150-156.

秦永華，張上隆. 草莓轉基因研究進展[J]. 遺傳， 2007，29（2）：150-156.

[2] KANG Hou-xiang， JIANG Feng， YANG Guo-shun. Progress in transgene of strawberry[J]. Biotechnology Bulletin， 2006（Suppl.）：67 -69

康厚祥，姜豐，楊國順. 草莓轉基因研究進展[J]. 生物技術通報，2006（增刊）： 67-69.

[3] NOGUCHI Y， MOCHIZUKI T，SONE K. Breeding of a new aromatic strawberry by interspecific hybridization Fragaria ananassa× F. nilgerrensis[J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science， 2002， 71（2）： 208-213.

[4] MA Hong-xiang， CHEN Pei-du. Advances in research of using wild strawberry species with lower ploidy in strawberry breeding[J]. Journal of Fruit Science， 2003，20（4）： 305-309.

馬鴻翔，陳佩度. 草莓屬低倍性野生資源在育種中利用的研究進展[J]. 果樹學報，2003， 20（4）： 305-309.

[5] LEI Jia-jun， YANG Gao， DAI Han-ping， WU Lu-ping， DENG Ming-qin. Chinas strawberry wild germplasm resources[J]. Journal of Fruit Science，1997，14（3）198-200.

雷家軍， 楊 高， 代漢萍， 吳祿平，鄧明琴. 我國的草莓野生種質資源[J]. 果樹科學， 1997，14（3）： 198-200.

[6] XU Ding-hua，XIANG Jun，XU Xia-ling，ZHANG Qing-lin. Cryopreservation of plant germplasm resources[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，2007， 35（2）： 321-323.

徐定華， 項俊， 徐霞玲，張青林. 超低溫保存技術在植物種質資源研究中的應用[J]. 安徽農業科學， 2007，35（2）： 321-323.

[7] ZHONG Lan， LIU Yu-ping， PENG Jing. Plant germplasm resources in vitro preservation technology research[J]. Journal of Changjiang Vegetables，2009（16）： 4-7.

鐘蘭， 劉玉平， 彭靜.植物種質資源離體保存技術研究進展[J]. 長江蔬菜， 2009（16）： 4-7.

[8] SHAO Li，WANG Zi-cheng. Review of genetic stability research for plant germplasm cryopreservation[J]. Plant Physiology Communications， 2010，11（46）： 1109-1113.

邵麗，王子成. 植物種質超低溫保存遺傳穩定性的研究進展[J].植物生理學通訊，2010，11（46）： 1109-1113.

[9] LI Shan，ZHAO Gui-fang. AFLP molecular marker and its application[J]. Acta Botanica Boreali-occidentalia Sinica，2003，23（5）： 830 -836.

李珊， 趙桂仿. AFLP分子標記及其應用[J]. 西北植物學報， 2003， 23（5）： 830-836.

[10] TURNER S， KRAUSS SL， BUNN E. Genetic fidelity and viability of Anigozonihosiridis following tissue culture， cold storage and cryopreservation[J]. Plant Science， 2001， 161： 1099-1106.

[11] HAO Yu-Jin， LIU Qun-Long， DENG Xiu-Xin. Effect of cryopreservation on apple genetic resources at morphological， chromosomal and molecular levels[J]. Cryobiology， 2001，43： 46-53.

[12] BASU C. Gene amplification from cryopreserved Arabidopsis thaliana shoot tips[J]. Curr Issues Mol Biol， 2008， 10： 55-60.

[13] SISUNANDA R， RIVAL A， TURQUAY P， SAMOSIR Y，ADKINS S W.Cryopreservation of coconut （Cocos nucifera L.） zygoticembryos does not induce morphological， cytological or molecular changes in recovered seedlings[J]. Planta， 2010， 232： 435-447.

[14] ARONEN T S， KRAJNAKOVA J， HAGGMAN H M， RYYNANEN L A. Geneticfidelity of cryopreserved embryogenic cultures of open-pollinated Abies cephalonica[J]. Plant Science，1999， 142： 163-172.

[15] KAITY A， ASHMORE S E， DREW R A， DULLOO M E. Assessment of genetic and epigenetic changes following cryopreservation in papaya[J]. Plant Cell Rep， 2008，27： 1529-1539.

[16] PEREDO E L， ARROYO-GARCIA R， REED B M， REVILLA M A. Genetic and epigenetic stability of cryopreserved and cold storedhops （Humulus lupulus L.）[J]. Cryobiology， 2008，57： 234-241.

[17] HE Yan-xia，WANG Zi-cheng. Variation of DNA methylation in arabidopsis thaliana seedlings after the cryopreservation[J]. Chinese Bulletin of Botany，2009，44（3）： 317-322.

何艷霞， 王子成.擬南芥幼苗超低溫保存后DNA甲基化的遺傳變異[J]. 植物學報， 2009，44（3）： 317-322.

[18] JOHNSTON J W， BENSON E E， HARDING K. Cryopreservation induces temporal DNA methylation epigenetic changes and differential transcriptional activity in Ribes germplasm[J]. Plant Physiol Biochem，2009，47： 123-131.

[19] LI Jun-hui， HE Ping， CHEN Xiao-ling， LU Xin-xiong， XIN Xia， ZHANG Zhi-e， XIN Ping-ping. Cryopreservation of in vitro shoot-tips of banana（Musa spp.）[J]. Journal of Plant Genetic Resources，2010， 11（1）： 34-39.

李俊慧， 何平， 陳曉玲， 盧新雄， 辛霞， 張志娥， 辛萍萍.香蕉離體莖尖超低溫保存研究[J]. 植物遺傳資源學報， 2010，11（1）： 34-39.

[20] MICHELI M R， BOVA R， PASCALE E， AMBROSIO D. Reproducible DNA fingerprinting with the random amplified polymorphic DNA （RAPD） method[J]. Nucleic Acids Res，1994， 22： 1921-1922.

[21] CERVERA M， RUIZ-GARCIA L， MARTINEZ-ZAPATER J. Analysis of methylation in Arabidopsis thaliana based on methylation-sensitive AFLP markers[J]. Mol Genet Genomics，2002，268： 543-552.