‘琯溪蜜柚’熒光定量PCR內參基因的篩選

王梨嬛　潘永娟　楊莉　蔡盛華　黃新忠

摘 要：【目的】為了克隆‘琯溪蜜柚的管家基因，并篩選合適的管家基因作為內參，【方法】以‘琯溪蜜柚盛花期后5個不同時期的果實汁胞，以及根﹑莖﹑葉為材料，采用實時熒光定量PCR技術，分析actin1﹑β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α 和 Ubiquitin 5 個管家基因在不同材料中的表達情況，并結合 geNorm、NormFinder﹑comparative Delta-CT 和 BestKeeper 4 種評估方法進行穩定性分析。【結果】結果表明， actin1和β-tubulin是‘琯溪蜜柚果實發育進程中較為穩定的內參基因，而 EF1-α和β-tubulin 則是研究不同組織特定靶基因表達中穩定的內參基因。【結論】篩選出了‘琯溪蜜柚最佳的內參基因β-tubulin，為今后目的基因的表達分析奠定了基礎。

關鍵詞： ‘琯溪蜜柚； 熒光定量PCR； 內參基因

中圖分類號：S666.3 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0048-07

實時熒光定量 RT- PCR（ real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR， qRT- PCR ）是在傳統 PCR 技術基礎上發展而來的一種新型、高效的核酸定量技術，實現傳統 PCR 從定性到定量的飛躍，具有實時性、速度快、高通量及自動化程度高等特點，目前已廣泛應用于分子診斷、生命科學、農業及醫學等領域的基因表達、DNA/RNA 拷貝數檢測，以及單核苷酸多態性等方面的研究[1-4]。

基因表達分析已廣泛應用于生命科學眾多研究領域，對發現和預測新基因及其功能、了解基因調控的復雜網絡等有重要作用。在基因表達研究中，要精確判斷特定靶基因表達的水平，需要有一個穩定表達的內參基因將未知樣本總核酸量標準化[5]。目前一般選擇管家基因作為內參，但很多管家基因隨環境、物種、組織來源及試驗條件等改變，其表達水平也有所變化[6]。因此，針對特定試驗條件和樣品選擇合適的內參基因對靶基因進行標準化，是獲得準確基因表達結果的重要前提[7-8]。

‘琯溪蜜柚[Citrus grandis （L.） Osbeck ‘Guanxi Sweet Pummelo]屬亞熱帶常綠喬木果樹，是我國特有的柚類良種，以其皮薄、肉嫩、汁多、酸甜適口等優良品質而享譽海內外，具有較高的經濟價值。目前，運用生理和分子生物學手段研究柑橘類各種次生代謝產物的調控及其機制已經成為研究熱點[9-17]。本研究應用 qRT- PCR 技術及 4 種可行性方法評估 5 個內參基因的表達穩定性，篩選‘琯溪蜜柚不同果實發育時期及不同組織最適的內參基因。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本實驗以 2008 年和 2009 年的‘琯溪蜜柚[Citrus grandis （L.） Osbeck ‘Guanxi Sweet Pummelo]盛花期后（ days after flowering， DAF ）45、75、105、135、165 d 的果實汁胞，以及根﹑莖﹑葉組織為材料，每份材料重復 3 次取樣。所用材料由福建省農科院果樹所提供，樣品采集后于 -80 ℃ 凍存備用。本試驗所使用的實時熒光定量 PCR 儀為 Applied Biosystem 公司 StepOne PlusTM PCR 儀，PCR 管為 Applied Biosystem 公司配套的 8 連管和管蓋。FS Universal SYBR Green Master 試劑盒購自 Roche 有限公司，引物由上海英濰捷基有限公司合成。其他常規試劑分別從北京科百奧生物科技有限公司與金華醫藥公司購買。

1.2 RNA 提取及cDNA 一鏈合成

參照徐昌杰等[18]的改良 Bugos 法提取樣品總 RNA，提取的總 RNA 經紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測質量與濃度。

取 1 μg 總 RNA，參照 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit （Fermentas 公司）使用說明合成 cDNA 一鏈，保存于 -20 ℃ 備用。

1.3 ‘琯溪蜜柚 actin1、 β-tubulin﹑ 18S rRNA﹑EF1-α 和 Ubiquitin 內參基因片段的克隆

在 NCBI 網站搜索內參基因 actin1、β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α 和 Ubiquitin 序列，選取與柚親緣關系較近物種的保守序列設計引物（表 1），以‘琯溪蜜柚 DAF 165 果實汁胞 cDNA 一鏈為模板，采用高保真 Taq DNA 聚合酶分別擴增上述 5 個管家基因，并連接至 pEASY-Blunt 平末端克隆載體，獲得的克隆送上海英濰捷基有限公司測序驗證。

1.4 ‘琯溪蜜柚 actin1、 β-tubulin﹑ 18S rRNA﹑EF1-α 和 Ubiquitin 內參基因 qRT-PCR 引物設計

參照實時熒光定量 PCR 引物設計原則，以克隆的 5 個‘琯溪蜜柚內參基因片段為模板，應用 Primer Premier 5.0 軟件，設計 qRT-PCR 反應引物（表 2）。

1.5 內參基因的 qRT-PCR 分析

qRT-PCR反應體系中分別加入2 × SYBR Green 10 μL、10 μmol·L-1 forward primer 0.4 μL、10 μmol·L-1 reverse primer 0.4 μL、cDNA一鏈模板（稀釋15倍）1 μL，添加ddH2O 補足至總反應體系 20 μL。每樣品重復3次。qRT-PCR反應條件為：95 ℃ 預變性 5 min，95 ℃ 3 s，退火及延伸 45 s，40次循環。反應結束后進行熔解曲線分析及瓊脂糖凝膠電泳鑒定產物的特異性。

1.6 數據分析

利用 EST Database of Cotton 網站（http：//www.leonxie.com/referencegene.php）中內參分析軟件進行數據在線處理，該在線軟件共包含 geNorm﹑NormFinder﹑comparative Delta-CT 和 BestKeeper 4 種內參基因評估方法，對各個內參基因的表達穩定性進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 樣品總 RNA 質量檢測

如圖 1所示，所提取的 RNA條帶清晰明亮，28S RNA 條帶熒光亮度是 18S RNA 條帶的 1.5～2.0 倍，沒有蛋白質、多糖、鹽或其他雜質的污染，可用于后續試驗。

2.2 內參基因片段的克隆

經測序驗證5 個‘琯溪蜜柚內參基因片段均與其他物種對應序列有較高的同源性，表明所克隆片段為‘琯溪蜜柚相應的內參基因。將獲取的內參基因片段序列提交至NCBI 網站，獲取GenBank登錄號分別為：actin1（JQ248013）、18S rRNA（JQ343046）﹑ EF1-α（JQ353767）和 Ubiquitin（JQ343045），另外 β-tubulin序列已由福建農林大學的Chen和Yang提交至NCBI，序列號為 JN580588。

2.3 普通RT-PCR預擴增內參基因片段

以 DAF 165 果實汁胞 cDNA 一鏈為模板，應用熒光定量 PCR 引物分別擴增 actin1﹑β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α 和 Ubiquitin 5 個內參基因片段。如圖 2 所示，5 個內參基因均能擴增出特異條帶，與預期片段大小一致；無引物二聚體，表明引物特異性較好，可用于后續 qRT-PCR 分析。

2.4 qRT-PCR擴增內參基因片段

以‘琯溪蜜柚果實不同發育時期汁胞及組織 cDNA 一鏈為模板，進行 qRT-PCR 分析。如圖 3 所示，‘琯溪蜜柚 5 個內參基因在不同樣品中溶解曲線均呈單一信號峰，表明所用引物均能特異地擴增相應內參基因，不存在引物二聚體；并且重復之間差異小（ Ct 值差異小于1）。同時，分別對 5 對引物的 qRT-PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果每對引物均能擴增出預期大小的特異條帶（結果同圖 2）。上述結果表明，本實驗中實時定量 RT-PCR 結果是準確可信的，最終取 3 次重復的平均 Ct 值用于后續數據分析。

2.5 內參基因的分析選擇

“EST Database of Cotton”是一在線數據庫，在其“softwares and tools”欄有關于內參基因穩定性和變異系數的評價系統，該系統包括 geNorm﹑NormFinder﹑comparative Delta-CT 和 BestKeeper 4 種用于篩選穩定的 qPCR 內參基因數據分析方法。如圖 4 A 所示，除 BestKeeper 法分析 18S rRNA 是相對較穩定的內參基因之外，其余3種方法均判斷 actin1 和 β-tubulin 是‘琯溪蜜柚果實發育進程中較為穩定的內參基因；EF1-α 和 β-tubulin 是‘琯溪蜜柚不同組織中較穩定的內參基因圖 4 B。

3 討 論

實時熒光定量 PCR 技術現已成為分子生物學研究的重要工具，要想獲取確實可信的基因表達結果，需要有合理可行的實驗設計、嚴格精準的實驗操作、較高的 RNA 質量和逆轉錄效率、引物設計及正確的數據分析等。除此之外，還需選擇穩定的內參基因。大量的研究結果表明，不同植物的最合適的內參基因均不相同，且同一植物不同組織之間內參基因的穩定性也存在一定差異。盲目地使用一種管家基因作為內參，一方面可能使基因表達的微小差異難以發現，另一方面可能產生錯誤甚至相反的結論[1，7-8]。因此，適宜內參基因的選擇應取決于研究者的實驗條件，在一種實驗條件下合適的內參基因并不一定適用另一種實驗條件，不同植物間內參基因也是不同的。在研究目的基因表達豐度之前，有必要對內參基因的表達穩定性進行評價，并選出適合在不同實驗條件下使用的內參基因。理想的內參基因應滿足以下條件：（1）無假基因；（2）穩定表達于不同類型的細胞或組織，且表達水平相近，無顯著性差別；（3）表達水平與目標基因相似；（4）不受任何內源性或外源性因素的影響[7，19-20]。事實上，所有基因在不同細胞或組織中、細胞的不同生理時期、不同外界刺激條件下，其表達豐度都會有所改變，甚至是幾十倍、上百倍的差異[8，19]。

另外，不同的評估方法對實驗結果也有一定的影響，需運用多種分析方法綜合評估以確保準確性。在本實驗中，我們應用 geNorm﹑NormFinder﹑comparative Delta-CT 和 BestKeeper 4 種數據評估方法，分析發現其中BestKeeper 數據評估結果與前 3 種方法略有差異，其可能的原因是： 在試驗中18S rRNA 表達量相對較高，Ct 值顯著低于其他內參基因，經 BestKeeper 分析得出的 CV 值也相對偏小。由于 geNorm 軟件將每個候選內參基因與其他內參基因的配對表達水平比值經過對數轉換，計算標準差，更適用于準確定量的內參數目[21]。

植物分子生物學研究領域有大量關于內參基因篩選的研究，其中在模式、經濟作物中研究較多，如擬南芥、水稻、番茄、油菜等[22-25]，也發現并鑒定出新的一些內參基因，如UNK1、MTP、FBOX、PP2A和 rpII 等。至于柑橘類，Mafra等[26]從 15 個候選基因中發現 FBOX、SAND、GAPC2 和 UPL7 適用于甜橙 （C. sinensis Osbeck） 等 7 種柑橘基因型及生物脅迫處理材料的基因定量分析。嚴佳文等[27]分析發現 ACTB 在沙田柚 （C. grandis Osbeck） 等 6 種柑橘基因型葉片中表達較穩定，18S rRNA 和 rpII 在花瓣和果皮中表達相對穩定。本研究發現 β-tubulin 是‘琯溪蜜柚果實發育不同時期和不同組織中均較為穩定的內參基因，而 actin1 和 EF1-α 則分別適用于‘琯溪蜜柚果實發育不同時期和不同組織的基因定量分析。

參考文獻 References：

[1] BUSTIN S A，BENES V，GARSON J A，HELLEMANS J， HUGGETT J， KUBISTA M， MUELLER R， NOLAN T， PFAFFL M W， SHIPLEY G L， VANDESOMPELE J， WITTWER C T. The MIQE Guidelines： minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments[J]. Clinical Chemistry， 2009， 55： 611-622.

[2] HALLER F， KULLE B， SCHWAGER S， GUNAWAN B， HEYDEBRECK A V， SULTMANN H， FUZESI L. Equivalence test in quantitative reverse transcription polymerse chain reaction： confirmation of reference genes suitable for normalization[J]. Annal Biochemistry， 2004， 335： 1-9.

[3] HEID C A， STEVENS J， LIVAK K J，WILLIAMS P M. Real time quantitative PCR[J]. Genome Research， 1996， 6： 986-994.

[4] KUBISTA M， ANDRADE J M， BENGTSSON M， FOROOTAN A， JONAK J， LIND K， SINDELKA R， SJOBACK R， SJOGREEN B， STROMBOM L， STAHLBERG A， ZORIC N. The real-time polymerase chain reaction[J]. Molecular Aspects of Medicine， 2006， 27： 95-125.

[5] HUGGETT J， DHEDA K， BUSTIN S， ZUMLA A. Real-time RT-PCR normalization； strategies and consideration[J]. Genes and Immunology， 2005， 6： 279-284.

[6] JIAN B， LIU B， BI Y R， HOU W S， WU C X ，HAN T F. Validation of internal control for gene expression study in soybean by quantitative real-time PCR[J]. BMC Molecular Biology， 2008， 9： 59-72.

[7] THELLIN O， ELMOUALIJ B， HEINEN E， ZORZI W. A decade of improvements in quantification of gene expression and internal standard selection[J]. Biotechnology Advances， 2009， 27： 323-333.

[8] GUENIN S， MAURIAT M， PELLOUX J， WUYTSWINKEL O V， BELLINI C， GUTIERREZ L. Normalization of qRT-PCR data： the necessity of adopting a systematic， experimental conditions-specific， validation of references[J]. Journal of Experiment Botany， 2009， 60： 487-493.

[9] XU C J， FRASER P D， WANG W J， BRAMLEY P M. Differences in the carotenoid content of ordinary citrus and lycopene-accumulating mutants[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006a， 54： 5474-5481.

[10] XU J， TAO N G， LIU Q， DENG X X. Presence of diverse ratios of lycopene/β-carotene in five pink or red-fleshed citrus cultivars[J]. Scientia Horticulturae， 2006b， 108： 181-184.

[11] TAO N G， XU J， CHENG Y J， DENG X X. Lycopene-epsilon-cyclase pre-mRNA is alternatively spliced in Cara Cara navel orange （Citrus sinensis Osbeck）[J]. Biotechnology Letters， 2005， 27： 779-782.

[12] TAO N G， HU Z Y， LIU Q， XU J， CHENG Y J， GUO L L， GUO W W， DENG X X. Expression of phytoene synthase gene （Psy） is enhanced during fruit ripening of Cara Cara navel orange （Citrus sinensis Osbeck）[J]. Plant Cell Reports， 2007， 26： 837-843.

[13] FANCIULLINO A L， DHUIQUE-MAYER C， LURO F， MORILLON R， OLLITRAULT P. Carotenoid biosynthetic pathway in the citrus genus： number of copies and phylogenetic diversity of seven genes[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2007， 55： 7405 -7417.

[14] ALQUEZAR B， RODRIGO M J， ZACARIAS L. Regulation of carotenoid biosynthesis during fruit maturation in the red-fleshed orange mutant Cara Cara[J]. Phytochemistry， 2008， 69： 1997-2007.

[15] PAN Z Y， LIU Q， YUN Z， GUAN R， ZENG W F， XU Q， DENG X X. Comparative proteomics of a lycopene-accumulating mutant reveals the important role of oxidative stress on carotenogenesis in sweet orange （Citrus sinensis osbeck）[J]. Proteomics，2009， 9： 5455 -5470.

[16] YE J L， ZHU A D， TAO N G， XU Q， XU J， DENG X X. Comprehensive analysis of expressed sequence tags from the pulp of the red mutant Cara Cara navel orange （Citrus sinensis Osbeck）[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2010， 52： 856-867.

[17] ZENG Y L， PAN Z Y， DING Y D， ZHU A D， CAO H B， XU Q， DENG X X. A proteomic analysis of the chromoplasts isolated from sweet orange fruits （Citrus sinensis Osbeck）[J]. Journal of Experimental Botany， 2011， 62： 5297-5309.

[18] XU Chang-jie， CHEN Kun-song， ZHANG Bo， WANG Qian-jie， YE Wei-jia. A study on methods for RNA extraction from Citrus tissues[J]. Journal of Fruit Science， 2004，21： 136-140.

徐昌杰， 陳昆松， 張波， 王錢潔， 葉薇佳. 柑橘組織RNA提取方法研究[J]. 果樹學報， 2004， 21： 136-140.

[19] HU Rui-bo， FAN Cheng-ming， FU Yong-fu. Reference gene selection in plant real-time quantitative reverse transcription PCR （qRT-PCR）[J]. Journal of Agricultural Science and Technology， 2009， 11： 30-36.

胡瑞波， 范成明， 傅永福. 植物實時熒光定量 PCR內參基因的選擇[J]. 中國農業科技導報， 2009， 11： 30-36.

[20] HENDRIKS-BALK M C， MICHEL M C， ALEWIJNSE A E. Pitfalls in the normalization of real-time polymerase chain reaction data [J]. Basic Research in Cardiology， 2007， 102： 195-197.

[21] VANDESOMPELE J， KUBISTA M， PFAFFL M W. Reference gene validation software for improved normalization[C]. Real-time PCR： Current Technology and Applications， 2009： 47-63.

[22] HONG S M， BAHN S C， LYU A， JUNG H S， AHN J H. Identification and testing of superior reference genes for a starting pool of transcript normalization in arabidopsis[J]. Plant and Cell Physiology， 2010， 51： 1694-1706.

[23] KIM B R， NAM H Y， KIM S U， KIM S I， Y J. Normalization of reverse transcription quantitative-PCR with housekeeping genes in rice[J]. Biotechnology Letters， 2003， 25： 1869-1872.

[24] LΦ？譈VDAL T， LILLO C. Reference gene selection for quantitative real-time PCR normalization in tomato subjected to nitrogen， cold，and light stress[J]. Analytical Biochemistry， 2009， 387： 238-242.

[25] CHEN X， TRUKSA M， SHAH S， WESELAKE R J. A survey of quantitative real-time polymerase chain reaction internal reference genes for expression studies in Brassica napus[J]. Analytical Biochemistry， 2010， 405： 138-140.

[26] MAFRA V， KUBO K S， ALVES-FERREIRA M， RIBEIRO-ALVES M， STUART R M， BOAVA L P， RODRIGUES C M， MACHADO M A. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions[J]. PLoS ONE， 2012， 7： e31263.

[27] YAN Jia-wen，YUAN Fei-rong，LONG Gui-you，TAN Lei， DENG Zi-niu. Selection and expression stability of reference genes in different citrus species[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2010， 37（Suppl.）： 2098.

嚴佳文，袁飛榮，龍桂友，覃磊，鄧子牛. 柑橘內參基因的篩選及其表達穩定性分析[J]. 園藝學報， 2010， 37（增刊）： 2098.