基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接技術探討六味地黃丸治療抑郁癥的作用機制*

張俊霞，晁利芹，王付

河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046

抑郁癥是一種嚴重危害人類健康的精神情感障礙性疾病[1]，臨床常表現(xiàn)為情緒低落、反應遲鈍、思維活動減退、失眠等精神癥狀，其病位主要在腦部。現(xiàn)代研究表明，抑郁癥與諸多因素相關，如炎性因子分泌、神經(jīng)遞質表達異常、神經(jīng)細胞通路改變、下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)持續(xù)紊亂、腸道菌群改變、線粒體結構異常等[2-4]。目前，西醫(yī)治療主要以服用抗抑郁藥物為主，短期療效尚可，但長期服用不良反應較多[5-6]。

抑郁癥作為現(xiàn)代醫(yī)學名詞，在中醫(yī)學歸屬于“郁病”范疇。近年來，隨著中醫(yī)藥在抑郁癥方面的深入研究，越來越多研究證實中藥、中藥復方可通過多靶點、多機制、多途徑來調節(jié)并改善抑郁癥[7-9]。中醫(yī)學認為，腦為髓之海，腎為生髓之器，腦部疾病采用補腎之法，療效顯著。宋代錢乙的六味地黃丸作為補腎經(jīng)典方劑具有“三補與三瀉”的特點，熟地黃、山藥、山茱萸補則益精填髓、滋水涵木，牡丹皮、澤瀉、茯苓瀉則平肝、疏肝、柔肝[10-11]。本研究應用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，構建“藥物活性成分-潛在作用靶點-信號通路”網(wǎng)絡，探究六味地黃丸治療抑郁癥的潛在靶點及其作用機制，為其進一步研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 六味地黃丸藥物活性成分及其相關靶點篩選采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)檢索六味地黃丸組方中熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉、茯苓的化學成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≧30%、類藥性(drug likeness，DL)≧0.18、血腦屏障(blood brain barrier，BBB)≧-0.3為條件對所獲得的化學成分進行篩選，得到符合條件的活性成分。運用PubChem數(shù)據(jù)庫(https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、BABEL軟件、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)、SEA在線平臺(http：//sea.bkslab.org/)預測活性成分的相應靶點，并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(http：// www.uniprot.org/)將得到的靶點蛋白進行名稱規(guī)范整理[12-14]。

1.2 六味地黃丸治療抑郁癥的潛在靶點預測使用DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https：//www.disgenet.org/)獲取抑郁癥的疾病靶點，并運用Venn Diagram平臺(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對六味地黃丸活性成分相關靶點及抑郁癥疾病靶點進行映射，得到交集靶點，即為六味地黃丸治療抑郁癥的潛在作用靶點。

1.3 蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡構建將六味地黃丸治療抑郁癥的潛在作用靶點輸入 STRING數(shù)據(jù)庫(https：//STRING-db.org/)，物種限定為人，設定置信度閾值≥0.9。將結果中的 node 1、node 2 數(shù)據(jù)信息輸入 Cytoscape 3.2.1 軟件進行數(shù)據(jù)可視化分析并構建 PPI 網(wǎng)絡，根據(jù) PPI 網(wǎng)絡中節(jié)點(node)度值(degree)的大小，篩選出關鍵靶點。

1.4 FunRich功能富集分析將六味地黃丸治療抑郁癥的潛在作用靶點輸入FunRich軟件，物種限定為人，設定P值≤0.01，進行功能富集分析。

1.5 “藥物活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡構建將六味地黃丸治療抑郁癥的潛在作用靶點與六地黃丸相關活性成分進行關聯(lián)，導入 Cytoscape 3.2.1 軟件，構建“藥物活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡圖，并進行拓撲分析篩選出關鍵成分[15-16]。

1.6 分子對接應用DockThor軟件將PPI 網(wǎng)絡中度值首位的靶點蛋白分別與六味中藥中拓撲分析參數(shù)首位的活性成分進行分子對接驗證(如果拓撲參數(shù)中的首位活性成分在PubChem 數(shù)據(jù)庫無法得到三維結構，將依序順接選擇相應活性成分)。從RCSB PDB 蛋白質結構數(shù)據(jù)庫(http：// www.rcsb.org/ pdb/home/home.do)獲得靶點蛋白的結構，并從PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得活性分子化合物的三維結構，采用DockThor平臺(https：// dockthor.lncc.br/v2/)對靶點蛋白和活性成分進行分子對接，得到結合能值 (affinity)，數(shù)值越小結合力越強。將所得結果導入PyMOL軟件，進行可視化繪圖分析。

2 結果

2.1 六味地黃丸活性成分及其相關作用靶點通過TCMSP獲得六味地黃丸化學成分508個，其中熟地黃76個，山藥71個，山茱萸226個，牡丹皮55個，澤瀉46個，茯苓34個。以OB≥30%、DL≥0.18、BBB≥-0.3為條件進行篩選后，獲得六味地黃丸活性成分40個，其中熟地黃2個，山藥12個，山茱萸14個，牡丹皮3個，澤瀉3個，茯苓6個。運用PubChem數(shù)據(jù)庫、BABEL軟件、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫、SEA平臺得到活性成分相關靶點 3 706 個，其中熟地黃200個，山藥1 100個，山茱萸1 303個，牡丹皮203個，澤瀉300個，茯苓600個。

2.2 六味地黃丸治療抑郁癥的潛在作用靶點使用DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲取抑郁癥疾病靶點1 478個。運用Venn Diagram平臺對六味地黃丸活性成分相關靶點與抑郁癥疾病靶點進行映射，得到抑郁癥疾病靶點與六味地黃丸活性成分相關靶點的交集靶點38個。

2.3 PPI網(wǎng)絡構建與分析將抑郁癥疾病靶點與六味地黃丸活性成分相關靶點的交集靶點導入 STRING數(shù)據(jù)庫中獲取靶點蛋白相互作用關系，導入Cytoscape 3.2.1軟件繪制 PPI 網(wǎng)絡圖，該網(wǎng)絡圖共有38個節(jié)點和101條邊，其中圓形表示蛋白質，圓形內為蛋白質的3D結構，邊代表蛋白之間的關聯(lián)。篩選出重要的子網(wǎng)絡，根據(jù)拓撲參數(shù)篩選得到絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)為首位關鍵靶點。見圖1、圖2及表1。

表1 PPI網(wǎng)絡子網(wǎng)絡靶點拓撲分析參數(shù)

圖1 PPI網(wǎng)絡圖

圖2 PPI網(wǎng)絡主要靶點的子網(wǎng)絡圖

2.4 “藥物活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡將六味地黃丸治療抑郁癥的潛在作用靶點與六地黃丸相關活性成分進行關聯(lián)，導入 Cytoscape 3.2.1 軟件，構建“藥物活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡圖，并進行拓撲分析篩選出關鍵成分。見表2。

表2 “藥物活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡拓撲分析參數(shù)

2.5 富集分析將38個交集靶點輸入FunRich軟件進行功能富集分析，得到生物過程13個，包括蛋白質代謝、新陳代謝、能量途徑、轉運、細胞通路、信號轉導、神經(jīng)遞質代謝、核酸酶調控、核苷、核苷酸和核酸代謝、基因表達調控、骨重建、G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號通路、激素代謝、轉錄；細胞組分37個，主要包括細胞質、細胞膜等；分子功能15個，主要包括轉錄因子活性、轉運體活性、氧化還原酶活性等；通路有319條，主要包括Cdc42活性調節(jié)通路、質膜雌激素受體信號傳導通路等。見圖3-圖6。

圖3 生物過程富集分析圖

圖4 細胞成分富集分析圖

圖5 分子功能富集分析圖

圖6 生物通路富集分析圖

2.6 分子對接將靶點蛋白MAPK3分別與六味中藥拓撲分析參數(shù)值首位的活性成分進行分子對接驗證。若結合能<0，表明配體分子能和受體蛋白自發(fā)地結合；結合能<-5.0 kJ·mol-1，表明其結合性好，結合能越小對接越好[17]。采用PyMOL軟件做可視化處理。黃色虛線代表氫鍵，與氫鍵結合的氨基酸處理成紅色。分子對接發(fā)現(xiàn)，化合物均穩(wěn)定地位于對接口袋內。豆固醇與活性位點附近的氨基酸PRO-347形成氫鍵結合到MAPK3。薯蕷皂苷與活性位點附近的3個氨基酸ASN-138、GLU-171、ARG-78形成氫鍵結合到MAPK3。丁子香萜與活性位點附近的2個氨基酸GLU-328、ARG-15形成氫鍵結合到MAPK3。[(1S，3R)-1-[(2R)-3，3-dimethyloxiran-2-yl]-3-[(5R，8S，9S，10S，11S，14R)-11-hydroxy-4，4，8，10，14-pentamethyl-3-oxo-1，2，5，6，7，9，11，12，15，16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]butyl]acetate與活性位點附近的3個氨基酸LYS-328、ARG-38、ARG-78形成氫鍵結合到MAPK3。麥角甾烷-7，22-二烯-3β-醇與活性位點附近的氨基酸PRO-347形成氫鍵結合到MAPK3。見表3、圖7。

表3 六味地黃丸活性成分與MAPK3的分子對接結果

注：A-F：熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉、茯苓中的活性成分與MAPK對接圖；藍色線條：化合物分子；紅色線條：與化合物相連的氨基酸；虛線：化合物與蛋白質相連的氫鍵圖7 重要活性成分與核心靶點的分子對接圖

3 討論

近年來，關于六味地黃丸臨床應用研究的探討逐漸引起關注[18-21]，多圍繞在抗炎、抗氧化應激、抑制PKC活性、調節(jié)多元醇通路、改善細胞損傷等方面[22-25]，關于六味地黃丸抗抑郁的作用機制研究較少。目前，抑郁癥的發(fā)病機制尚未完全闡明，而六味地黃丸復方成分復雜。為全面了解六味地黃丸治療抑郁癥的作用機制，本研究運用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術探討六味地黃丸治療抑郁癥的作用機制。

研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸的活性成分40個，治療抑郁癥的相關靶點38個，充分證明了六味地黃丸治療抑郁癥多成分、多靶點的作用特點。六味地黃丸治療抑郁癥的潛在靶點蛋白PPI網(wǎng)絡圖中共有38個節(jié)點、101條邊，各靶點間存在多種相互作用，其中靶點的自由度越大，表明六味地黃丸通過該靶點治療抑郁癥的可能性越大，根據(jù)拓撲參數(shù)篩選得到MAPK3為首位關鍵靶點。根據(jù)“藥物活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡拓撲參數(shù)分析得出，熟地黃主要作用成分是豆固醇、谷固醇；山藥關鍵作用成分是薯蕷皂苷、異巖藻糖甾醇、豆固醇、山酮C、海風藤酮、玉蘭脂素B、山蒟醇、蓽茇寧等；山茱萸主要有效成分為2，6，10，14，18-五甲基肼-2，6，10，14，18-五烯、康努達尼酮、亞麻酸乙酯、豆甾醇、鄰苯二甲酸二異辛酯、谷甾醇、β-谷甾醇等；牡丹皮的主要有效成分是丁子香萜、谷甾醇；澤瀉主要的有效成分是[(1S，3R)-1-[(2R)-3，3-dimethyloxiran-2-yl]-3-[(5R，8S，9S，10S，11S，14R)-11-hydroxy-4，4，8，10，14-pentamethyl-3-oxo-1，2，5，6，7，9，11，12，15，16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]butyl]acetate、乙酰澤瀉醇B、谷甾醇；茯苓的主要有效成分是麥角甾烷-7，22-二烯-3β-醇、麥角甾醇過氧化物、3β-羥基-24-亞甲基-8-羊毛脂烯-21-油酸、去氫齒孔酸、常春藤皂甙元、氫化松苓酸。以上結果可以看出，熟地黃、山藥、山茱萸均含有有效成分豆固醇，熟地黃、山茱萸、牡丹皮、澤瀉均含有有效成分谷固醇，與已有研究結果一致[26]。推測這些含有相同成分的中藥可能具有中藥配方的協(xié)同作用，其他中藥可能發(fā)揮相使作用。六味地黃丸組方中每味中藥的重要成分與MAPK3進行分子對接發(fā)現(xiàn)，熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉、茯苓的中藥活性成分與MAPK3的結合能均小于-7.0 kJ·mol-1，表明六味地黃丸組方中藥中的活性成分能高效結合抑郁癥的靶點，從而發(fā)揮治療作用。

通過FunRich軟件對六味地黃丸治療抑郁癥的38個交集靶點進行富集分析得出，六味地黃丸治療抑郁癥參與的生物過程有13個，包括神經(jīng)遞質代謝，信號傳導，能量通道、運輸、細胞通訊，蛋白質代謝，調節(jié)核酸堿基、核苷、核苷酸和核酸代謝，調節(jié)基因表達的表觀遺傳，骨重塑，G蛋白耦合的受體蛋白信號通路，激素代謝、轉錄；信號通路319條，主要包括Cdc42活性調節(jié)通路，Cdc42信號，細胞膜雌激素受體信號等；細胞成分37個，主要包括胞質，胞質膜等；分子功能15個，主要包括轉錄因子活性，轉運體活性，氧化還原酶活性等。

研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥的發(fā)生可能與神經(jīng)遞質相關[27-28]，患者腦內神經(jīng)遞質分泌不足導致自主神經(jīng)功能嚴重失調。神經(jīng)遞質主要有5-HT、NE、DA等單胺類和GABA、谷氨酸等氨基酸類，是維持神經(jīng)回路的物質基礎[29]。本課題研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸治療抑郁癥的生物過程含有神經(jīng)遞質代謝過程，這與已有文獻報道結果一致。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術初步揭示了六味地黃丸治療抑郁癥的作用機制，為其臨床應用提供了一定理論依據(jù)，同時為中醫(yī)藥治療抑郁癥疾病提供了新思路。