全自動在線固相萃取—二維高效液相色譜與質譜聯用測定辣椒油中蘇丹

摘 要：建立了全自動在線固相萃取-二維高效液相色譜與質譜聯用快速測定辣椒油中的蘇丹紅Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ， Ⅳ的方法。樣品經乙腈和二氯甲烷萃取后，在一維色譜柱（Acclaim PA Ⅱ， 150 mm × 3.0 mm × 3 μm）上分離出蘇丹紅，通過閥的分段切換，依次富集在SPE柱（Acclaim 120 C18，10 mm × 4.6 mm × 5 μm）上，在線完成凈化和萃取富集；再通過閥切換將它們轉移至二維色譜流路，在Acclaim 120 C18色譜柱（100 mm ×2.1 mm × 2.2 μm）上分離檢測。一維色譜以水-乙腈-甲醇/四氫呋喃（1∶1，V/V）為流動相，進樣體積20 μL，0.6 mL/min流速梯度洗脫和紫外-可見檢測器（λ=254 nm）監測分離狀況；二維色譜以水-乙腈-甲酸/乙腈（1∶1000，V/V）為流動相，0.3 mL/min流速梯度洗脫，采用單四極質譜儀，選擇離子方式檢測。整個分析流程27 min即可完成。4種蘇丹紅的保留時間的相對標準偏差均小于0.1%，色譜峰面積的相對標準偏差均小于2% （n=7）；在0.6～60 μg/L范圍內峰面積與進樣質量濃度的線性相關系數均大于0.9958；加標回收率為50%～97%；方法檢出限均小于0.2 μg/L （S/N=3）。測定結果令人滿意。

關鍵詞：蘇丹紅； 高效液相色譜； 二維液相色譜； 在線固相萃取； 辣椒油

1 引 言

蘇丹紅（Sudan dyes）是廣泛應用的人工合成偶氮類化工染料。長期的攝入會在體內累積而造成肌體損傷或基因突變而致癌。違禁用于食品著色的主要有蘇丹紅Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ， Ⅳ^[1]。食品中蘇丹紅的提取溶劑為乙腈、正己烷等^[2，3]，通常還輔以超聲^[4]或微波^[5]提取以提高萃取效率。萃取液的凈化方法有固相萃取（Solid phase extraction， SPE）^[6]、凝膠滲透色譜^[7]、薄層色譜^[8]和分散固相萃取^[9]等；測定方法有色譜、質譜、色譜-質譜聯用、光譜、電化學、酶聯免疫吸附、分子印跡等，但最常用的是高效液相色譜法（HPLC）。中國^[6]和歐盟^[10]均頒布了HPLC測定食品中的蘇丹紅的標準方法。國標GB/T19681-2005使用正己烷萃取，堿性氧化鋁凈化^[6]，步驟繁瑣，且氧化鋁的難以準確控制活化程度的缺陷會造成方法重現性較差。本研究利用雙三元高效液相色譜系統，采用二維色譜結合在線固相萃取技術完成辣椒油樣品中4種蘇丹紅的測定，實現了樣品的自動化凈化、富集和測定，提高了分析效率。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Thermo UltiMate 3000高效液相色譜儀，配置六通道在線脫氣機（SRD 3600 solvent rack with degasser）、雙三元超快速梯度泵（DGP-3600 RS pump）、可調速泵（LPG-3400 pump）、自動進樣器（WPS-3000T RS autosampler）、帶2個2位-10孔切換閥的柱溫箱（TCC-3000 thermostatted column compartment equipped with two 2p-10p valves）、紫外-可見檢測器（DAD-3000 RS UV-vis detector），MSQ Plus單四極桿質譜檢測器；變色龍色譜管理軟件Chromeleon 6.8 SR11； 色譜柱： Acclaim PAⅡ （分析柱1，150 mm × 3.0 mm × 3 μm），Acclaim RSLC 120 C18 （分析柱2，100 mm × 2.1 mm × 2.2 μm）和SPE柱 （Acclaim 120 C18，10 mm × 4.6 mm × 5 μm）， 均購自美國賽默飛世爾公司。ⅠKA旋渦振蕩器（德國ⅠKA集團）。

乙腈、甲醇（色譜級，Fisher公司）；甲酸、四氫呋喃（色譜級，國藥集團化學試劑有限公司）；二氯甲烷（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；蘇丹紅 Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ， Ⅳ 標準物質（Sigma-Aldrich公司）。去離子水（電阻率≥18.2 MΩ cm）。

2.2 標準儲備溶液和標準溶液配制

分別稱取10 mg蘇丹紅Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ和Ⅳ標準品置于同一只100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容。準確量取0.5 mL標準儲備液置于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，搖勻，得0.5 mg/L混合儲備液。

混合標準工作溶液： 分別量取適量的混合標準儲備液置于容量瓶中，用水稀釋、配制成0.5， 2.0， 5.0， 10， 30和60 μg/L的標準工作溶液，用于繪制標準工作曲線。

2.3 全自動二維高效液相色譜結合在線固相萃取與質譜檢測的流程及測定條件圖1顯示了包括2個10通切換閥、2根分析色譜柱、1根SPE柱、2臺檢測器（紫外-可見和質譜檢測器），以及2臺泵（雙三元超快速梯度泵和稀釋泵）的二維高效液相色譜結合在線固相萃取與質譜檢測的流程圖。一維色譜用于初步分離蘇丹紅組分，并隨后通過閥切換使它們依次被富集在SPE柱上。其流路從左泵開始，此時左、右切換閥均在1～10位。蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的分離以水-乙腈-甲醇/四氫呋喃（1∶1， V/V）為流動相，在分析柱1上進行。進樣體積20 μL，柱溫30 ℃，流速0.6 mL/min，梯度洗脫，在波長254 nm處監測分離狀況。洗脫梯度： 0～5 min， 30%水，50%乙腈，20%甲醇/四氫呋喃；5.5 min，50%乙腈， 50%甲醇/四氫呋喃；11～14 min，20%乙腈，80%甲醇/四氫呋喃；14.1～23 min，30%水，50%乙腈，20%甲醇/四氫呋喃。根據在紫外-可見檢測器上監測到的4種蘇丹紅的出峰時間，確定在右閥1～10位與1～2位之間的切換，將它們依次引入到SPE柱上，完成在線凈化和富集。與此同時，右泵用于二維色譜流路中分析柱2的平衡。另外，在左閥10位與右閥1位之間加了一個稀釋泵（可采用普通可調速蠕動泵），以1.0 mL/min流速連續注入濃度為0.1%的甲酸水溶液，用以稀釋來自于一維流路的高比例有機溶劑流動相，以利于被測組分在SPE柱上富集。

在一維色譜上完成凈化和富集后，左、右閥均切換至1-2位。此時，SPE柱被接入從右泵開始的二維色譜流路，而一維流路則進行分析柱1的平衡。二維色譜以水-乙腈-甲酸/乙腈（0.1∶100，V/V）為流動相，富集在SPE柱上的蘇丹紅組分被洗脫后在分析柱2上進行分離。流速0.3 mL/min，梯度洗脫，單四極桿質譜儀進行定性和定量。梯度： 0～7.0 min， 40%水，50%乙腈，10%甲酸/乙腈； 16～22.4 min，90%乙腈，10%甲酸/乙腈；22.5～23 min，40%水，50%乙腈，10%甲酸/乙腈。質譜條件： 采用ESI+離子模式，源溫度450 ℃，電壓4000 V。蘇丹紅Ⅰ ～ Ⅳ的SIM模式分別為m/z 249，277，353和381。滯后時間（Dwell time）為0.2 s，錐空電壓（Cone voltage）分別為35 V （蘇丹紅Ⅰ， Ⅱ）和50 V（蘇丹紅Ⅲ， Ⅳ），霧化氣壓力5×105 Pa。

2.4 樣品制備

稱取1 g辣椒油（精確至0.1 mg）置于100 mL容量瓶中，加入20 mL二氯甲烷溶劑，旋渦振蕩5 min后超聲30 min，用乙腈定容；再次超聲15 min后，移取10 mL混合液至離心管中，以10000 r/min離心10 min，取上層乙腈過濾0.45 μm濾膜過濾，待測。

3 結果與討論

3.1 樣品前處理方法探討

樣品前處理分為提取和凈化兩步。歐盟方法03/99^[9]使用乙腈提取辣椒油樣品中的蘇丹紅Ⅰ， Ⅱ，二氯甲烷提取蘇丹紅Ⅲ， Ⅳ。本研究中嘗試了采用乙腈提取，但蘇丹紅Ⅲ， Ⅳ的回收率偏低。因此采用歐盟方法03/99，同時輔以旋渦振蕩和超聲萃取。

樣品凈化是針對油類等具有復雜基質的樣品的前處理的關鍵。國標方法^[5]推薦使用活度四級的中性氧化鋁作為吸附劑進行離線固相萃取。但由于中性氧化鋁活度難以控制，且目前沒有已調整好活度的氧化鋁商品供應，從事相關檢測的實驗室自行進行氧化鋁活化、脫活及活度測定，造成檢驗結果重現性差。本實驗在線二維色譜結合在線固相萃取凈化技術，通過分段切入，將在一維色譜上得到初步分離的蘇丹紅組分依次保留到富集柱上，而大部分的雜質被排出，使之不能進入二維色譜。

3.2 實驗配置的優化

將二維色譜柱的出口連接到左閥9號位上（圖1流路①），此時在紫外-可見檢測器上通過閥切換可依次監測一維和二維色譜的分離情況。再將出口直接連接到質譜檢測器上（流路②），利用其高選擇性來提高方法的靈敏度。

樣品凈化由一維色譜柱和閥切換配合完成，富集被測組分則在SPE柱上完成。一維色譜粗分時，需要使用有機溶劑比例較高的流動相將蘇丹紅組分從一維色譜柱中順利洗脫；但有機溶劑比例較高的流動相不利于4種蘇丹紅在SPE柱上的富集。因此，在左閥10位與右閥1位之間加一個稀釋泵，以一定流速連續注入與二維流動相匹配的0.1%甲酸溶液，對來自于一維流路的流動相進行稀釋，使蘇丹紅組分能夠保留在SPE柱上，從而完成富集。流速不低于1.0 mL/min時，4種蘇丹紅均可獲得100%富集。

3.3 色譜條件的優化

4種蘇丹紅在反相色譜柱Acclaim PAⅡ和120 C18上均具有很好的分離。一維色譜可采用柱容量大一些的色譜柱提高樣品上樣量；二維色譜則采用粒徑和尺寸更小的色譜柱以獲得更好的色譜峰形和分離度，并與質譜檢測匹配。另外，在一維流動相中加入四氫呋喃，以利于延長樣品中天然色素的保留，消除干擾。