生物芯片波導共振光散射掃描裝置的研制

摘 要：以光波導（Optical/Light waveguide）作為激發方式，利用共振光散射（Resonance light-scattering，RLS）原理，研制微陣列生物芯片（Microarray）波導共振光散射掃描裝置。此裝置主要由光源部件、波導激發部件、光電轉換部件、機械傳動部件和上位機軟件組成。其最小掃描分辨率可達5 μm，最大掃描范圍100 mm。通過使用新的激發方式，有效提高了RLS的信噪比。使用白光作為激發光源，降低了設備的成本。對金納米粒子標記的單糖芯片、DNA芯片和多肽芯片的檢測結果表明，此裝置對溶液中的伴刀豆球蛋白凝集素（ConA）和靶標DNA的檢出限分別為1 ng/mL 和100 pmol/L，對芯片表面固定的多肽的檢出限為100 fg，較現有的商品生物芯片掃描儀降低1～2 個數量級。本裝置結構簡單，成本低廉。

關鍵詞：生物芯片； 波導激發； 共振光散射； 金納米粒子

1 引 言

生物芯片（Microarray）能夠實現對DNA、蛋白質、細胞等生物樣品的準確、快速與高通量的檢測^[1～8]。其原理是采用化學或物理方法，將大量探針固化于支持物的表面，然后根據生物分子之間的親和作用，如核酸分子的堿基配對作用，抗原抗體的結合等進行反應，再對反應信號進行檢測分析，即可得到該樣品的相關信息。隨著生物芯片的發展，對生物芯片檢測技術也提出了更高要求。目前，生物芯片主要采用熒光檢測方式^[9～14]，熒光檢測系統存在一些不足，如（1）熒光分子本身亮度有限，容易發生光淬滅和光漂白現象；（2）熒光掃描的背景噪音較高；（3）熒光生物芯片檢測系統通常使用單色激光作為激發光源并采用共聚焦的激發方式，儀器結構復雜，價格昂貴，檢測成本高。因此研發具有高靈敏度、高分辨率、低成本的非熒光染料標記的生物芯片檢測系統對發展生物芯片技術具有重要意義。

以納米粒子為標記物的共振光散射（Resonance light-scattering，RLS）檢測法被認為能夠極大地提高生物芯片的檢測靈敏度^[15～18]。直接表面激發是RLS最簡單的直接激發方式，但在這種激發方式下，背景噪聲隨著激發光強度的增加而增大。如何有效降低背景噪聲，并最大限度激發產生共振光散射，成為研發該類生物芯片檢測裝置的一個難題。光波導（Optical/Light waveguide）是一種用于光波傳輸的裝置，其傳輸原理是在不同折射率的介質間，由于光的全反射現象使光波局限在波導及其周圍有限區域內傳播。為了解決RLS直接表面激發造成背景噪聲過高的問題，本研究設計了一種使用光波導作為激發方式的RLS掃描裝置（RLS scanner）。此裝置利用生物芯片基底作為光波導介質，激發位于生物芯片基底表面的金屬納米粒子，這一激發方式能夠有效去除激發光干擾并最大限度地利用激發光能量。因此，RLS scanner具有背景噪聲低，檢測靈敏度高等優點。RLS Scanner對金納米粒子標記的單糖芯片、DNA芯片和多肽芯片的檢測靈敏度均高于現有的商品生物芯片掃描儀，具有良好的應用及推廣價值。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ZKF035電熱真空干燥箱（上海實驗儀器有限公司）； HPC-250CL恒溫恒濕箱（上海申賢恒溫設備廠）； TH2-300恒溫培養搖床（北京桑翌科技發展有限公司）； PHS-3BWpH計（上海理達儀器廠）； 5415R型高速離心機（德國Eppendorf 公司）； PMC082芯片離心機（美國ChipMate公司）； SpotWareTM芯片掃描系統（美國Arrayit公司）；晶芯 SmartArrayerTM 48 微陣列芯片點樣系統、晶芯 LuxScanTM 10K 微陣列芯片掃描儀（北京博奧生物有限公司）；NRT100電動位移導軌、DCC1240C相機（美國Thorlabs公司）。

4-氨基苯基-α-D-甘露吡喃糖（4-Aminophenyl α-D-mannopyranoside，Man-α）、伴刀豆球蛋白凝集素（Biotin-Con A）、銀增強溶液（Sliver enhancer），購自美國Sigma-Aldrich公司；熒光素標記的親和素（Avidin，fluorescein conjugate，美國Invitrogen 公司）；DNA寡聚物（5′-TAA CAA TAA TCC-NH2-3′，5′-GGA TTA TTG TTA AATATT GAT AAG GAT-3′，5′-HO（CH2）6-S-S-（CH2）6-T10 ATCCTT ATC AAT ATT-3′，上海生工生物工程有限公司）；多肽（CALNNGK（biotin）G，北京中科亞光生物技術有限公司）；牛血清蛋白（BSA，北京鼎國生物有限公司）；光學級三維高分子D基片（北京博奧生物有限公司）；其它試劑均為國產分析純試劑，實驗用水為Milli-Q超純水（18.2 MΩ cm）。

2.3 軟件設計

上位機軟件的主要功能包括：CCD圖像采集、CCD曝光及增益控制、多軸電動導軌控制、數據提取，陣列ROI（Region of interest，ROI）數據提取、數據分析和數據存儲等。圖像采集區域負責預覽生物芯片掃描信息，對特定區域進行精度更高的掃描定位；掃描控制區域涵蓋了復位、預掃描、精確定位和獲取圖像等主要控制功能；相機控制區域的主要功能是控制相機的曝光時間以及相機的增益補償；導軌控制區域提供對導軌的實時控制功能，電動導軌除具有自動掃描功能外， 還可以根據用戶的指令進行移動。

4 結 論

本實驗研制了一種新型生物芯片波導共振光散射掃描裝置。對金納米粒子標記的單糖芯片、DNA芯片和多肽芯片的檢測結果表明， 此檢測裝置對溶液中的反應物（Biotin-ConA和靶標DNA）和芯片表面固定的化合物（CALNNGK（biotin）G）的檢出限比商品化同類生物芯片掃描儀降低1～2個數量級，且背景噪聲低，靈敏度高。另外，與常規熒光激光共聚焦掃描儀相比，此裝置使用白光作為激發光源具有結構簡單，成本低廉等優點，因此具有較佳的應用及推廣價值。