基于噬菌體展示抗體的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測(cè)相思子毒素研究

摘 要：以多克隆抗體包被磁性微球制備捕獲探針，以表面負(fù)載大量三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記物的噬菌體展示抗體為發(fā)光探針有效放大信號(hào)，成功建立了相思子毒素電化學(xué)發(fā)光免疫傳感檢測(cè)方法。利用本方法檢測(cè)相思子毒素，濃度在0.005～100 μg/L范圍內(nèi)與電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈良好的對(duì)數(shù)線性關(guān)系，擬合方程為lgY=0.701lgX+1.767（R=0.9964，N=7，p<0.0001），檢測(cè)限達(dá)0.005 μg/L（S/N=3）。與采用單克隆抗體制備標(biāo)記探針相比，檢測(cè)靈敏度提高20倍，可用于相思子毒素的痕量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：噬菌體展示抗體； 相思子毒素； 電化學(xué)發(fā)光； 免疫傳感器

1 引 言

電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）免疫傳感器檢測(cè)蛋白類生物大分子多是以傳感器表面固定抗體為捕獲探針，以發(fā)光標(biāo)記物如聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）2+3]標(biāo)記抗體為發(fā)光探針，在靶標(biāo)存在的情況下，形成“捕獲探針-靶標(biāo)-發(fā)光探針”復(fù)合物，在電極表面發(fā)生ECL反應(yīng)，以此測(cè)定靶標(biāo)濃度^[1～5]。抗體活性以及標(biāo)記物的量將直接影響檢測(cè)的靈敏度。對(duì)于傳統(tǒng)抗體，分子表面可供標(biāo)記的基團(tuán)有限，而且多位點(diǎn)標(biāo)記也可能影響其結(jié)合活性，這限制了靈敏度的進(jìn)一步提高。

噬菌體展示抗體是通過(guò)噬菌體展示技術(shù)獲得的一種可溶性抗體片段或是表面展示有抗體片段的噬菌體^[6]，對(duì)于后者，其表面除了展示的抗體片段外就是大量的衣殼蛋白。以展示有單鏈抗體（Single chain variable fragments，scFv）的M13噬菌體為例，M13為絲狀，長(zhǎng)約900 nm，寬約8 nm，衣殼約由2800拷貝的5 kDa的主要衣殼蛋白pⅧ組成^[7]，scFv融合表達(dá)在位于一端的約5拷貝的次要衣殼蛋白pⅢ中的1個(gè)拷貝上。若進(jìn)行標(biāo)記，會(huì)有更多的標(biāo)記物連接在數(shù)量龐大的衣殼蛋白上^[8]，展示抗體僅僅是“躲在”一端的一個(gè)小角落里，從而被標(biāo)記上較少的標(biāo)記物，可最大限度避免多位點(diǎn)標(biāo)記造成的活性降低或消失。因此，噬菌體展示抗體做標(biāo)記探針能大大增加標(biāo)記物數(shù)量，而又最小程度影響結(jié)合活性，從而起到放大信號(hào)作用。

本研究以劇毒生物毒素相思子毒素（Abrin）為檢測(cè)目標(biāo)，以Abrin多克隆抗體（多抗）包被的磁微球?yàn)椴东@探針，以Ru（bpy）2+3標(biāo)記的Abrin噬菌體展示抗體為發(fā)光探針，將磁性微球分離富集與噬菌體展示抗體大量負(fù)載發(fā)光標(biāo)記物放大ECL信號(hào)相結(jié)合，建立了一種檢測(cè)Abrin的新方法，有效放大了檢測(cè)信號(hào)，提高了檢測(cè)靈敏度。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

磁免疫電化學(xué)發(fā)光傳感檢測(cè)平臺(tái)（本實(shí)驗(yàn)室與西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司聯(lián)合研制），MPI-E型電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司）；BIOMATE 3S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾科技）；HS-3垂直混合器（寧波新芝生物科技股份有限責(zé)任公司）；磁分離架（美國(guó)Promega公司）。

三聯(lián)吡啶釕N-羥基琥珀酰亞胺酯（Ru（bpy）2+3-NHS ester，美國(guó)Sigma公司），活化生物素（Biotin-NHS ester，美國(guó)Sigma公司）；鏈親和素包被磁微球（New England BioLabs公司，直徑2.0 μm），Abrin、Abrin多抗、Abrin單抗、Abrin噬菌體展示抗體、蓖麻毒素（Ricin）、葡萄球菌腸毒素B（SEB，本實(shí)驗(yàn)室）；發(fā)光檢測(cè)液與CleanCell清洗液（北京百隆騰科技發(fā)展有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）用0.1 mol/L Na2HPO4，0.1 mol/L KH2PO4和0.1 mol/L KCl配制而成；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水，其它所用化學(xué)品和試劑均為分析純。

2.2.2 捕獲探針制備 （1）Abrin多抗生物素化 用1 mL DMSO 溶解活化生物素1 mg，向1 mL Abrin多抗溶液（1 mg/mL）中加入120 μL 活化生物素溶液（即含活化生物素 120 μg）；在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2～4 h；加入9.6 μL 1 mol/L NH4Cl（每25 μg 活化生物素加1 μL），在室溫下攪拌10 min；超濾除去未結(jié)合的活化生物素，以PBS重懸至1 mL。（2）磁微球捕獲探針構(gòu)建 將生物素化的abrin多抗 20 μL加入1 mL（1 g/L）親和素包被的磁微球中，室溫振蕩孵育1 h，置于磁分離架上用PBST（含0.15% Tween-20的PBS）清洗兩次，PBS清洗兩次除去未結(jié)合的Abrin多抗，余下結(jié)合了Abrin多抗的磁微球，加PBS重懸至1 mL， 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 ECL檢測(cè) 將Abrin多抗包被的磁微球50 μL與50 μL樣品混合， 室溫振蕩孵育15 min，置于磁分離架上用PBS清洗兩次，再加入50μL 標(biāo)記探針混合后室溫振蕩孵育1 h，結(jié)合磁分離用PBS清洗兩次，用發(fā)光檢測(cè)液重懸后加入檢測(cè)池，磁微球復(fù)合物磁鐵作用下沉積在工作電極表面，在給定工作電極與參比電極之間恒定電壓1.4 V下，標(biāo)記在噬菌體上的Ru（bpy）2+3就和發(fā)光檢測(cè)液中的三丙胺（TPA）發(fā)生ECL反應(yīng)，光信號(hào)由光電倍增管（PMT）檢測(cè)。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程如圖1所示。ECL反應(yīng)結(jié)束后，將磁鐵位置移至離電極最遠(yuǎn)處，先用去離子水、CleanCell清洗液結(jié)合電化學(xué)階躍脈沖清洗檢測(cè)池與電極，再用去離子水和ProCell發(fā)光檢測(cè)液沖洗，直至ECL值恢復(fù)至基線水平（空白信號(hào)）后進(jìn)行下一輪檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 發(fā)光探針性質(zhì)

3.1.1 發(fā)光探針紫外-可見(jiàn)光譜 如圖2所示，Abrin噬菌體展示抗體經(jīng)標(biāo)記后其紫外-可見(jiàn)光譜發(fā)生改變，a為abrin噬菌體展示抗體光譜圖，在269 nm處有一個(gè)特征吸收峰，因?yàn)槭删w顆粒為衣殼蛋白內(nèi)包裹著核酸，269 nm處反映的是DNA的吸收峰；b為標(biāo)記物Ru（bpy）2+3-NHS ester的圖譜，聯(lián)吡啶釕在220～600 nm之間有3個(gè)特征吸收峰，其中可見(jiàn)光457 nm處的吸收對(duì)應(yīng)于金屬Ru到bpy配體dπ→π*電荷躍遷， 紫外區(qū)287 nm處的吸收是以配體為中心的π→π*躍遷，紫外區(qū)的另一個(gè)吸收峰在245 nm處，也是金屬Ru到bpy配體的dπ→π*電荷躍遷^[11]； c為Ru（bpy）2+3標(biāo)記Abrin噬菌體展示抗體的光譜圖，位于285 nm吸收峰應(yīng)對(duì)應(yīng)于聯(lián)吡啶釕287 nm的吸收峰，254 nm處吸收應(yīng)對(duì)應(yīng)于聯(lián)吡啶釕245 nm處的吸收，稍紅移，457 nm處為聯(lián)吡啶釕的特征吸收，這表明Ru（bpy）2+3-NHS ester已經(jīng)標(biāo)記到噬菌體展示抗體上。

3.2 孵育時(shí)間的確定

因Abrin單鏈抗體展示于M13噬菌體表面，且M13較大，且為長(zhǎng)絲狀，其運(yùn)動(dòng)相對(duì)抗體來(lái)說(shuō)非常緩慢，又因scFv位于一端，這降低了M13與Abrin接觸的幾率，有必要對(duì)孵育時(shí)間進(jìn)行考察。Abrin濃度為50 μg/L時(shí)，在加入Ru（bpy）2+3標(biāo)記的Abrin噬菌體展示抗體后分別孵育10， 20， 30， 40， 50， 60， 70和80 min，隨孵育時(shí)間增加，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化見(jiàn)圖4。孵育時(shí)間小于60 min時(shí)，隨孵育時(shí)間增加發(fā)光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；孵育時(shí)間大于60 min時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度趨于平穩(wěn)。說(shuō)明室溫下的M13參與的結(jié)合反應(yīng)在60 min后基本達(dá)到飽和。因此，加入標(biāo)記探針后孵育時(shí)間定位 60 min。

4 結(jié) 論

利用展示有Abrin單鏈抗體的M13噬菌體作為載體構(gòu)建發(fā)光標(biāo)記探針，在M13噬菌體表面固載大量的三聯(lián)吡啶釕信號(hào)分子，有效放大了發(fā)光信號(hào)，成功建立了高靈敏、高特異性的夾心式新型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感檢測(cè)方法。本方法較使用單抗作標(biāo)記探針在靈敏度上提高20倍，又由于噬菌體展示抗體相對(duì)傳統(tǒng)抗體的高度穩(wěn)定性，可依此為基礎(chǔ)發(fā)展生物毒素的現(xiàn)場(chǎng)痕量檢測(cè)方法以及開(kāi)發(fā)性能穩(wěn)定的試劑盒。