洛克沙胂分子印跡聚合物的制備及其固相萃取研究

摘 要：以阿散酸為虛擬模板分子，2-乙烯吡啶為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，合成了對洛克沙胂具有高選擇性的分子印跡聚合物。通過考察致孔劑、單體及交聯劑等因素對合成聚合物性能的影響，獲得優化聚合配方為：阿散酸、2-乙烯吡啶、乙二醇二甲基丙烯酸酯、甲醇-乙腈（1∶1，V/V）及偶氮二異丁腈之比為1 mmol∶4 mmol∶20 mmol∶6 mL∶60 mg。合成印跡聚合物對洛克沙胂的最大吸附量為0.93 mg/g，作為固相萃取填料分離、富集洛克沙胂的優化萃取條件為：水和乙腈活化平衡，乙腈上樣，水和甲醇依次淋洗，5%甲酸甲醇溶液洗脫。洛克沙胂在分子印跡固相萃取柱上的回收率達到95%以上，而非分子印跡固相萃取柱的回收率僅為43.1%。制備小柱應用于池塘水中洛克沙胂的凈化富集，檢測限可達0.05 mg/L。

關鍵詞：分子印跡聚合物； 洛克沙胂； 固相萃取； 虛擬模板

1 引 言

洛克沙胂（Roxarsone，ROX）是畜禽抗菌、促生長有機胂類藥物（圖1），長期大量使用會嚴重造成環境中砷污染，歐盟已禁止ROX作為雞飼料添加藥物，農業部第235號公告也規定了ROX的最高殘留限量（MRLs）。因此，開展從復雜基質中高選擇性分離凈化洛克沙胂的前處理技術研究具有重要意義。

目前，飼料中洛克沙胂的測定主要采用高效液相色譜法^[1～4]。樣品凈化采用傳統的復合陰離子固相萃取小柱^[5]，其選擇性不高，特異性不強，對飼料復雜基質中洛克沙胂的測定有一定影響。近年來，用分子印跡聚合物（Molecularly imprinted polymer，MIP）作為特異性填料的固相萃取技術受到廣泛關注^[6～9]。為防止MIP應用中的“模板泄露”現象^[10]，本研究選擇與ROX結構相似的阿散酸（Arsanilic acid，ASA）為虛擬模板分子（圖1），成功合成了對ROX顯示高交叉反應的MIP，作為固相萃取填料，在優化的固相萃取條件下，制備的MIP小柱對ROX具有很好的選擇性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Waters 2695-2487型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Vario EL cube型元素分析儀（德國Elementar公司）；170 SX型紅外光譜儀（美國Nicolet公司）。

洛克沙胂及阿散酸原料藥（含量≥99%，湖北理想生物科技有限公司）。甲基丙烯酸（MAA）、丙烯酰胺（AM）及偶氮二異丁腈（AIBN），天津市科密歐化學試劑開發中心；2-乙烯吡啶（2-VP）及4-乙烯吡啶（4-VP），Johnson Matthey公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）及三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM），Sigma-Aldrich公司。其它試劑均為分析純。

2.2 MIP的制備

分別將ASA溶于甲醇或甲醇-乙腈（丙酮或氯仿）（1∶1，V/V）中，加入2-VP（4-VP，MAA或AM），超聲混合5 min，最后加入EGDMA（或TRIM）和AIBN，超聲混合，于冰浴上吹氮氣5 min，密封，60 ℃真空干燥箱中反應24 h，得塊狀聚合物。研磨、過篩（粒度為38～54 μm），甲醇反復沉降除去細小顆粒，用乙酸-甲醇（1∶9， V/V）溶液洗滌去除模板，甲醇洗去乙酸，真空干燥，備用。

2.3 吸附試驗

稱取20 mg聚合物于25 mL系列錐形瓶中，再加入2 mL系列濃度的ROX標準乙腈溶液（1.00～300 mg/L），混合，室溫下，放置5，15，30，60，90，120 min及24 h，離心，上清液中未吸附的ROX用HPLC測定。

2.4 固相萃取優化

稱取50 mg MIPs顆粒裝填于1 mL帶有濾板的聚丙烯空柱中，制成分子印跡固相萃取（MISPE）小柱。考察不同的活化、上樣、淋洗和洗脫條件下MISPE柱對ROX的保留能力。洗脫液吹干后用流動相復溶。

3.1.2 單體的選擇 4種功能單體（MAA，2-VP，4-VP及AM）合成聚合物的固相萃取回收率實驗結果表明，堿性2-VP為單體制備的MIP對ROX吸附非常好，回收率達到97.6%，NIP僅有40.2%；而酸性MAA和中性AM為單體制備的MIP對ROX基本不保留，說明堿性單體制備的MIP與酸性的ROX之間相互作用力較強，可能主要通過離子鍵作用吸附。但以4-VP為單體制備的MIP對ROX的吸附回收率約80%，且不穩定，表明MIP中單體的吡啶殘基的空間位置對ROX的吸附也有較大影響，鄰位吡啶殘基形成的MIP三維空穴較對位吡啶殘基形成的空穴更有利于ROX的穩定結合。不同摩爾比的ASA與2-VP制備的聚合物對ROX回收率結果（圖4）表明，最佳比率是1∶4，此時MIP回收率達到98%，NIP則只有42.8%，特異性與非特異性之間差異最大。

3.3.2 洗滌和洗脫液的選擇 實驗表明，用水和甲醇或乙腈依次洗滌都可除去大部分非特異性吸附，獲得滿意的洗滌效果（MISPE回收率均在95%以上，NISPE回收率則小于45%）。考慮甲醇洗滌去除雜質能力更強，本實驗選擇水和甲醇洗滌。基于文獻[11]，考察了氨化和酸化甲醇的洗脫效果。實驗表明，酸或堿甲醇體系都能有效洗脫ROX，獲得理想的回收率，但氨化甲醇小柱再生較難，實驗選擇酸化甲醇為洗脫溶液。1，2和3 mL的5%甲酸甲醇溶液均可以有效洗脫ROX，回收率在90%以上。隨著洗脫液體積增大，ROX的回收率反而降低，這可能與后續吹干有關，洗脫液體積越大，吹干損失會越多。因此，本實驗選擇5%甲酸甲醇溶液2 mL作為洗脫液。

3.4 MISPE的選擇性

實驗表明，制備的ASA-印跡聚合物對ROX顯示高度交叉反應（ROX回收率達到95%以上，是NIP的2倍以上），但ASA模板本身卻在兩種柱上保留相對偏低。根據分子印跡原理，模板分子一般在相應的印跡聚合物上的保留是最強的，但在一定條件下，模板類似物的保留可能比模板更強^[12，13]。這是由于模板類似物與模板分子結構非常相似，且模板類似物與功能單體之間的相互作用大于模板本身與功能單體之間的相互作用。本實驗現象可能是ROX分子中的酚羥基與制備的ASA-印跡聚合物中特異識別位點的相互作用更強。

同時，為進一步考察MISPE小柱的特異性，還選擇了與ASA結構差異較大的硝碘酚腈及二甲氧芐啶進行交叉反應實驗。結果表明，與ROX同樣具有羥基和硝基的硝碘酚腈回收率約45%，顯示一定的交叉反應，而結構完全不同的堿性二甲氧芐啶回收率僅2.2%，無交叉反應。

3.5 實際樣品檢測

為評價制備的MIP小柱的實際應用性能，采集10份養殖場池塘水進行凈化富集，均未檢出ROX（檢測限0.05 mg/L）。圖8為池塘水試樣添加0.5 mg/L洛克沙胂經MISPE和NISPE萃取、凈化富集的HPLC色譜圖。

4 結 論

上述結果表明， 采用虛擬模板技術，合成了對ROX具有高選擇性的MIP；作為固相萃取吸附材料，MISPE小柱可有效凈化富集環境水中ROX。