甲醛選擇性反應探針用于表面增強拉曼散射檢測脂多糖

摘 要：構建了一種依賴于表面增強拉曼散射（SERS）技術檢測脂多糖氧化產物甲醛，實現對脂多糖的定量檢測。在室溫條件下，用NaIO4氧化脂多糖生成甲醛，加入巰基拉曼染料4-氨基-3-肼基-5-巰基-1，2，4-三氮唑（Purpald）與甲醛加合，再加入NaIO4進一步氧化，生成的紫色終產物組裝到金納米顆粒表面，在進行拉曼光譜掃描時產生了SERS增強信號，而在控制實驗中沒有脂多糖參與時，得到非常弱的SERS信號，由此實現脂多糖的檢測。此外，利用紫外可見光譜對脂多糖的氧化產物進行了分析，在540 nm處有甲醛與Purpald加成產物特征的紫外吸收。還對NaIO4、Purpald的反應濃度進行了優化，結果表明，在最優反應條件下，SERS信號隨著脂多糖濃度增大而增強，在33～667 mg/L范圍內有很好的線性關系，檢出限為21 mg/L。本方法無需復雜的實驗操作和昂貴的標記試劑。分析速度快，靈敏度高。

關鍵詞：脂多糖； 金納米顆粒； 表面增強拉曼散射

1 引 言

細菌等微生物的鑒定和檢測在發酵工程、醫療實踐和環境監測方面都具有重要意義。作為細菌的內毒素，脂多糖（LPS）已經成為診斷革蘭氏陰性細菌的重要標志^[1，2]。脂多糖是革蘭氏陰性細菌細胞壁外壁層的主要成分，用于保持細胞外膜的完整性和避免細菌受到外界抗生素的入侵^[3]。脂多糖由O-特異性多糖鏈、核心多糖鏈和類脂A三部分組成^[4，5]。脂多糖可以從細菌的細胞壁上脫落， 釋放進入人體，產生免疫反應，引起敗血性休克，器官衰竭，嚴重時甚至導致死亡^[6，7]。在美國，每年敗血癥和敗血性休克的患者多達150000^[8]。世界范圍內，尤其是對于生存環境惡劣和水源不能進行滅菌處理的地區，這個數字仍在上升。因此，脂多糖的分析對相關疾病的診斷和治療有著重要的意義。目前已經報道的脂多糖檢測的方法包括內毒素鱟試劑測定法（Limulus amebocyte lysate，LAL）^[9]，氣相色譜-質譜分析^[10]，電化學分析^[11，12]，功能化聚二乙炔脂質體的比色^[13]和熒光分析^[14]，熒光共振能量轉移用于研究熒光基團標記的脂多糖結合肽信標與脂多糖的相互作用^[15]，以及基于陽離子的高聚物或者合成化學小分子的分析方法等^[16～20]。但是，這些方法或需要繁瑣的酶反應，或探針需要標記和復雜的化學合成。

表面增強拉曼散射（SERS）技術因具有高靈敏、高選擇性以及適合均相物質結構研究等特點，逐漸在生物學、分析科學、材料科學以及表面科學等方面得到廣泛應用^[21～24]。由于脂多糖分子中存在鄰二醇結構，可被NaIO4氧化生成甲醛，利用醛類反應探針可以實現SERS的化學增強效應。本研究建立了一種依賴于表面增強拉曼散射技術檢測脂多糖氧化產物甲醛來實現對脂多糖的定量檢測的方法。所用反應活性探針是4-氨基-3-肼基-5-巰基-1，2，4-三氮唑（Purpald），該探針可以選擇性地與甲醛加成^[25]，加合產物可以通過巰基自組裝到金納米顆粒（AuNPs）表面，產生增強的SERS信號。與傳統方法相比，本方法簡單方便、快速、靈敏，且不需要酶反應及復雜的化學合成和標記等優點，且引入了一段較短的親水性多肽用于金納米顆粒的表面修飾，提高了金納米顆粒的穩定性^[26]。

2 實驗部分

2.1 材料與試劑

大腸桿菌脂多糖（E.coli LPS），由本實驗室提取，首先對大腸桿菌菌株進行活化、篩選、擴大培養，然后收集生長旺盛期的細菌，制成細菌懸液。獲得的菌液經5000 r/min離心20 min，0.9% NaCl離心洗滌1～2次， 制成濃菌液。用超聲波發生器中頻（相當于12000 cps）處理20 min。處理液經3000 r/min離心30 min，吸取上清液即為大腸桿菌脂多糖，真空旋干。4-氨基-3-肼基-5-巰基-1，2，4-三氮唑（Purpald，西格瑪公司）。親水性多肽Peptide序列：Cys-Ala-Leu-Asn-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu（上海A′Peptide 公司合成純化， 純度>95%）。其它試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

2.2 多肽修飾金納米顆粒的制備

采用檸檬酸鈉還原HAuCl4法制備金納米顆粒。制備平均粒徑為30 nm的金納米顆粒：200 mL超純水中加入500 μL 4% （w/w） HAuCl4，攪拌下加熱至沸騰后迅速加入2.5 mL 1%（w/w）檸檬酸鈉，待溶液顏色不再改變后繼續攪拌加熱15 min，然后置于室溫下冷卻，4 ℃保存。使用UV 2450紫外可見分光光度計（日本島津公司）測得該金溶膠的吸收波長為530 nm，則粒徑為30 nm。

取2 mL所制備的AuNPs 10000 r/min離心10 min，用水定容至600 μL，在攪拌的條件下緩慢加入64 μL 0.01 g/LPeptide，用0.2 mol/L NaOH調節pH 6～8，在4 ℃放置過夜。將上述AuNPs-peptide 10000 r/min離心10 min，純水洗去未標記上Peptide，最后定容至200 mL，所得AuNPs-peptide溶液的濃度為3 nmol/L，放置4 ℃備用。

3 結果與討論

3.1 基于SERS檢測技術用于脂多糖分析的實驗設計

利用甲醛選擇性反應探針Purpald， 設計了一種新型生物傳感器，通過檢測脂多糖氧化產物甲醛和Purpald的加合產物，實現對待測物革蘭氏陰性細菌的標志分子脂多糖含量的SERS檢測，原理如圖1所示。文獻[27]報道，脂多糖分子中含有多種糖結構，其中庚糖和2-酮基-3-脫氧辛烷（2-keto-3-deoxyoctonate，kdo）分子中含有的鄰二醇結構易被NaIO4氧化產生甲醛。脂多糖分子被NaIO4氧化而生成的甲醛與Purpald反應，產物被NaIO4進一步氧化， 生成的紫色終產物， 通過巰基自組裝于多肽修飾的金納米顆粒表面， 產生拉曼增強信號；而在控制實驗中，Purpald 自組裝到金納米顆粒表面產生非常弱的拉曼信號。該方法與其它檢測方法相比具有很多優點： （1）反應探針Purpald幾乎沒有背景拉曼信號，它自身可以作為一種非熒光型拉曼染料，可降低熒光背景干擾，而它與甲醛的加合產物由于存在較好的π共軛效應，具有很強的拉曼信號，因此提高了信背比； （2）金納米顆粒表面修飾了短的親水性多肽，可增強金納米顆粒在反應體系中的穩定性； （3）均相反應，且無需任何的生物分子標記，降低了實驗成本，實驗步驟簡單、易于操作，檢測時間短，提高了實驗的可操作性。

3.4 實驗條件優化

對脂多糖氧化反應中的NaIO4加入濃度進行了優化，結果如圖4所示。隨著NaIO4濃度的增加，固定濃度的脂多糖（500 mg/L）產生的SERS信號逐漸增強，這主要是因為NaIO4濃度相對于脂多糖是不足夠的，因此更多的NaIO4使脂多糖氧化更充分。當NaIO4濃度到達1.1 mmol/L時出現平臺，說明NaIO4已經能夠氧化全部的脂多糖，且在此濃度下信背比最高，因此選擇此濃度進行后續反應。另外，為了保持體系的穩定，NaIO4濃度優化幅度不大，因為過多的Na+會影響體系的穩定性。在實驗所優化的范圍內體系較為穩定，也未觀察到納米金團聚的現象。

對甲醛選擇性反應試劑Purpald的濃度也進行了優化（圖5）。由圖5可見，隨著Purpald試劑濃度的增加，固定濃度的脂多糖（500 mg/L）產生的SERS信號先增加，達到最高值后降低。這是因為足夠的Purpald試劑濃度是保證加成反應順利高效進行的條件，但是過多的Purpald會與加成產物競爭吸附到納米金表面，降低SERS信號。Purpald最佳反應濃度為22.7 mmol/L，選擇該濃度用于定量分析。

4 結 論

構建了基于甲醛選擇反應探針用于SERS檢測脂多糖的分析方法。方法依賴于脂多糖中含有的鄰二醇結構被氧化生成甲醛，甲醛與Purpald發生加成反應，并進一步氧化生成紫色的終產物，該產物組裝到多肽標記的金納米顆粒表面可增強SERS信號。與傳統方法相比，本方法無需復雜的化學合成和標記，不需要酶反應，均相、靈敏、快速、易于實現。綜上優點，本方法為革蘭氏陰性細菌標志分子脂多糖的檢測提供了一個簡單，方便，靈敏，重現性好的均相檢測平臺。