氧化應激損傷中NKFB1基因多態性對細胞凋亡的影響

周韻

摘 要：目的：人原代臍靜脈內皮細胞（HuvECs）通過氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導從而建立體外氧化應激損傷模型，觀測NF-κB1基因啟動子區-94號位點ATTG插入/缺失（rs28362491，-94ins/del ATTG）對細胞凋亡的影響。方法：檢測ox-LDL對細胞活性影響的適宜時間及濃度，并通過ox-LDL誘導HUVECs建立氧化應激損傷模型，通過Western blot法分別檢測空白對照組及ox-LDL誘導組NFKB1不同基因型的細胞凋亡情況。結果：MTT結果顯示：HuvECs通過100umol/L ox-LDL誘導12h細胞活力即可顯著降低;Western blot檢測結果顯示：ox-LDL可誘導HuvECs發生細胞凋亡，且DD型凋亡水平較II型顯著增高。結論：ox-LDL誘導HUVECs可促使細胞發生凋亡，且NFKB1不同基因型中細胞凋亡水平具有顯著差異。

關鍵詞：NFKB1;氧化應激;冠心病;凋亡

1 研究背景

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary artery disease，冠心病）是60歲以上人群的首要死亡原因。炎癥反應是冠心病發生發展的核心機制，其中NF-κB信號通路處于炎癥反應的中心環節，因而冠心病的發生發展與NF-κB1基因啟動子區-94號位點ATTG插入/缺失（rs28362491，-94ins/del ATTG）密切相關，但多數研究僅進行了大樣本人群篩查工作，并未對其產生機制進行進一步探索研究。基于此，本研究擬通過檢測NF-κB1基因啟動子區多態性，觀測不同基因型細胞間的凋亡水平差異，從而通過篩查個體基因類型提高冠心病的早期診斷能力，同時為易感個體提供個體化治療，降低其心血管疾病的并發癥、死亡率提供理論基礎。

2 研究方法

2.1 材料

M199培養基、胰蛋白酶購自HyClone公司，胎牛血清購買于杭州四季青生物工程系有限公司，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）購自廣州奕源生物科技有限公司，MTT購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司公司，兔抗人BCL-2、BAX抗體購自上海碧云天生物技術有限公司。臍靜脈內皮細胞取自新疆醫科大學第一附屬醫院。

2.2 方法

2.2.1 氧化應激損傷模型建立及分組

將HUVEC細胞在37℃、5%CO2條件下進行培養，96孔板5000細胞/孔進行鋪板，分別加入0、50、100、150umol/L ox-LDL刺激HUVEC 0、4、8、12、24h。培養結束后去除孔內培養基，每孔加入200ul濃度為100ng/ml MTT的完全培養基，培養4h后去除培養基，每孔加入100ul DMSO，震蕩10min后酶標儀495nm檢測吸光值。根據所得數據，選擇最適濃度及時間對不同基因型HUVECs進行分組誘導。實驗分為空白組和ox-LDL誘導組，各組再根據HuvECs的NFKB1基因型分組，分別為：DD型組、II型組。

2.2.2 NFKB1基因多態性在細胞凋亡的影響

分別收集四組細胞，提取細胞蛋白，通過BCA法進行蛋白定量檢測。Western Blot法分別檢測凋亡相關蛋白：BAX、BCL-2表達水平。電泳中每道蛋白上樣體積為10ul：分別包含蛋白10ug，5×上樣緩沖液2ul，剩余體積用蛋白裂解液補足;結束后采用電轉法將蛋白轉至PVDF膜上;轉模后，50g/L脫脂奶粉室溫封閉2h;0.05ml/L TBST洗膜;再分別加入1∶1000稀釋的兔抗人BAX、BCL-2抗體，4℃孵育過夜;TBST洗膜;加入1∶1000稀釋的堿性磷酸酶標記的抗兔二抗，室溫孵育2h;TBST洗膜;加入BCIP/NBT顯色。以BCL-2/BAX的吸光度比值進行半定量分析。

3 結果

3.1 氧化應激損傷模型建立

MTT結果顯示：100umol/L ox-LDL誘導12h可顯著降低細胞活性，使細胞發生氧化應激損傷反應，因此后續實驗采取此誘導濃度及誘導時間建立模型。

3.2 NFKB1基因多態性對細胞凋亡的影響

Western Blot檢測結果顯示：各組細胞蛋白提取物中BAX及BCL-2蛋白均有表達，且ox-LDL誘導組凋亡水平顯著高于空白對照組，其差異存在統計學意義（P<0.05）;通過分析ox-LDL誘導組內DD型、II型亞組BAX與BCL-2比值結果發現：II型HuvECs凋亡水平遠低于DD型，其差異存在統計學意義（P<0.05）。Western Blot檢測結果表明：ox-LDL可誘導HuvECs產生凋亡，且NFKB1 II型細胞凋亡水平顯著低于DD型。

4 討論

本實驗通過對HuvECs采用ox-LDL誘導建立體外氧化應激損傷模型，在此次基礎上明確了體外氧化應激損傷模型中NF-κB1-94ATTG ins/del不同基因型在細胞凋亡中的影響，其結果表明：與突變純合子DD型相比，純合子II型具有較低的細胞凋亡水平。

綜上所述，本研究證實了氧化應激損傷中NFKB1基因多態性對細胞凋亡的重要意義，為今后冠心病的早期診斷和個體化治療提供了理論依據。

參考文獻：

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項目：陜西省教育廳專項科研計劃項目（18JK0679）