B7-H1在肝癌中的表達及其對肝癌細胞增殖和凋亡的影響

黎　靖　陳　紅　雷正明　付文廣　淦　宇　蔣　禹　溫　劍　李　秋　李　波

(瀘州醫學院附屬醫院肝膽外科，四川　瀘州　646000)

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B7-H1在肝癌中的表達及其對肝癌細胞增殖和凋亡的影響

黎靖陳紅雷正明付文廣淦宇蔣禹溫劍李秋李波

(瀘州醫學院附屬醫院肝膽外科，四川瀘州646000)

〔摘要〕目的探討B7-H1在人肝癌組織中的表達情況及其對肝癌HepG2細胞增殖能力和凋亡水平的影響。方法采用組織化學染色方法觀察肝癌組織和癌旁正常組織中B7-H1的表達情況。采用Lonza電轉染的方法轉染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2進入肝癌HepG2細胞，并通過RT-PCR和Weatern印跡方法檢測肝癌HepG2細胞中B7-H1的表達情況。敲低肝癌HepG2細胞中B7-H1的表達后，采用MTT方法檢測肝癌HepG2細胞的增殖情況，并采用Annexin V/7-AAD雙染的方法檢測肝癌HepG2細胞的凋亡水平。結果與癌旁正常組織相比，肝癌組織中B7-H1的表達水平顯著升高。采用Lonza電轉染的方法轉染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2進入肝癌HepG2細胞后，肝癌HepG2細胞中-B7-H1的表達水平均顯著降低。轉染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2敲低肝癌HepG2細胞中B7-H1表達后，肝癌HepG2細胞的增殖能力均顯著降低，與對照組相比差異顯著(P<0.01)。轉染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2敲低肝癌HepG2細胞中B7-H1表達后，肝癌HepG2細胞的凋亡均顯著升高，與對照組相比差異顯著(P<0.01)。結論肝癌組織中B7-H1的表達水平顯著升高，且B7-H1可促進肝癌HepG2細胞的增殖能力，并抑制肝癌HepG2細胞的凋亡水平，提示肝癌組織中高表達的B7-H1與肝癌的發生和發展密切相關。

〔關鍵詞〕肝癌；B7-H1；增殖；凋亡

B7-H1(B7 homolog 1)是B7家族的第三個成員，又稱為程序性死亡配體(PD-L1)。B7-H1主要表達于T細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突細胞〔1，2〕。近年來的研究發現，B7-H1具有促進腫瘤進展的功能，且在多種腫瘤細胞均存在B7-H1不同程度的表達上調〔3，4〕。而關于B7-H1在肝癌組織的表達及其對肝癌細胞增殖和凋亡能力的影響目前研究還不是很多，本研究旨在觀察B7-H1對肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1臨床資料選取2013 年12月1日至2014 年12月01日在我科住院并行手術治療的肝癌患者50例。患者術前均未接受化學治療、放射治療或免疫治療，收取患者癌組織標本，同時收集50例患者癌旁組織標本作為對照。組織標本離體后10 min內凍存于液氮中保存。每例樣本均經過組織病理學診斷證實為肝癌，癌旁組織亦均經過組織病理學診斷證實未見腫瘤進入。患者的平均年齡(58.1±17.1)歲。

1.2細胞及主要試劑人肝癌細胞系HepG2購自中國醫學科學院基礎醫學研究所，細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中。辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG及免疫組織化學染色試劑盒購自中杉金橋生物技術有限公司；轉染試劑購自Lonza公司；si-B7-H1-1和si-B7-H1-2購自Invitrogen公司；B7-H1和Actin抗體購自Santa Cruz公司；Annexin V/7-AAD染色試劑盒購自Biolegend公司。

1.3免疫組織化學染色方法標本采用甲醛固定、石蠟包埋的組織進行，具體操作方法參見文獻報道〔5〕。

1.4電穿孔轉染法嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5Western印跡肝癌HepG2細胞總蛋白經10% SDS-PAGE 分離膠和5%濃縮膠分離后，通過半干轉膜儀將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜隨后采用含5% BSA 的TBST室溫孵育封閉2 h，于適量封閉液加入鼠抗人p-Smad2和p-Erk1/2抗體，4℃過夜孵育。次日以0.1% TBST 洗滌硝酸纖維素膜3次，5 min/次，加入相應種屬的HRP標記二抗，室溫孵育1 h。0.1% TBST 子弟硝酸纖維素膜后，采用Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化學發光底物對條帶進行顯色。β-actin作為內參對照。所有實驗至少重復3次。

1.6MTT方法檢測細胞增殖能力肝癌HepG2細胞培養至對數生長期，接種于96孔培養板中，每孔中加入20 μl的MTT溶液，作用4 h后吸出上清，加入150 μl的DMSO溶液，低速震蕩10 min后，波長490 nm處測定OD值。

1.7凋亡染色方法嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.8統計學方法采用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1B7-H1在肝癌組織中的表達情況免疫組織化學染色結果顯示，癌旁正常組織僅6例(12.0%)為B7-H1染色陽性；而肝癌組織有24例(48.0%)。肝癌組織B7-H1表達水平與癌旁正常組織相比顯著升高。見圖1。

圖1　肝癌組織B7-H1免疫組織化學染色結果(×100)

2.2B7-H1在肝癌HepG2細胞中的表達情況轉染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2可顯著降低肝癌HepG2細胞中B7-H1的mRNA表達水平(分別為0.38±0.06，0.48±0.09)，parental組為1.00±0.39，si-control組為1.14±0.43；同時，轉染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2亦可顯著降低肝癌HepG2細胞中B7-H1的蛋白表達水平。見圖2。

圖2　敲低B7-H1在肝癌HepG2細胞中的表達效果檢測

2.3B7-H1對肝癌HepG2細胞增殖能力的影響如圖3所示，轉染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2敲低肝癌HepG2細胞中B7-H1表達后，肝癌HepG2細胞的增殖能力均顯著降低，與對照組相比差異顯著(P<0.01)。

2.4B7-H1對肝癌HepG2細胞凋亡水平的影響轉染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2敲低肝癌HepG2細胞中B7-H1表達后，肝癌HepG2細胞的凋亡均顯著升高〔分別為(14.13±4.13)%，(13.65±3.87)%〕，與對照組〔parental組為(6.94±1.86)%，si-control組為(7.08±1.74)%〕相比差異顯著(P<0.01)。

圖3　B7-H1對肝癌HepG2細胞增殖能力的影響

3討論

免疫共刺激分子B7-H1(又稱為CD274)是新近發現的程序性死亡共抑制受體(PD-1)(又稱為CD279)的配體分子〔6〕。細胞被激活或在有IFN-α存在的條件下，B7-H1的表達可出現上調。除外表達于淋巴細胞，在心臟血管內皮細胞、微血管內皮細胞、胰島和胎盤組織中也檢測到低水平的B7-H1表達〔7〕。正常情況下，表達于抗原提呈細胞表面的B7-H1可通過于T細胞表面的PD-1相結合，而在誘導和維持免疫耐受中發揮重要作用。

近年來研究發現，B7-H1分子不僅表達于淋巴細胞和正常組織中，在惡性腫瘤中也有表達，包括肺、食道、頭頸部鱗癌以及其他類型的腫瘤，如乳腺癌、黑素瘤、膠質瘤、卵巢癌、膀胱鱗狀細胞癌〔8〕。腫瘤組織中表達的B7-H1分子與腫瘤預后不良密切相關，且與腫瘤惡性程度相關。動物實驗結果顯示，阻斷B7-H1的作用可加速腫瘤的消退〔9，10〕。腫瘤相關的B7-H1具有誘導細胞毒性T細胞(CTL)凋亡的作用，從而使得腫瘤科從T細胞介導的免疫監視作用中逃逸〔11〕。關于B7-H1在腫瘤發生發展中的作用研究還處于初期階段。Dong等〔11〕研究發現，在正常的結腸組織中不存在B7-H1的表達，而在惡性程度較高的結直腸癌組織中可檢測到B7-H1的表達。同時，Shi等〔8〕研究發現B7-H1的表達與結直腸癌的預后不良密切相關，同時具有調節結直腸癌細胞增殖和侵襲的功能。

本研究結果顯示，在肝癌組織中B7-H1的表達水平顯著升高；同時，B7-H1具有存進肝癌細胞增殖，并抑制肝癌細胞凋亡的作用，提示肝癌組織中高表達的B7-H1與肝癌的發生和發展密切相關。

4參考文獻

1Yan Z，Zhuansun Y，Liu G，etal.Mesenchymal stem cells suppress T cells by inducing apoptosis and through PD-1/B7-H1 interactions〔J〕.Immunol Lett，2014；162(1 Pt A)：248-55.

2Wang H，Qi F，Dai X，etal.Requirement of B7-H1 in mesenchymal stem cells for immune tolerance to cardiac allografts in combination therapy with rapamycin〔J〕.Transpl Immunol，2014；31(2)：65-74.

3Jang IK，Lee JH，Yoon HH，etal.Suppression of T-cell proliferation by and B7-H1 expression on human liver-derived stem cells〔J〕.Transplant Proc，2015；47(3)：784-6.

4Yang Y，Wu KE，Zhao E，etal.B7-H1 enhances proliferation ability of gastric cancer stem-like cells as a receptor〔J〕.Oncol Lett，2015；9(4)：1833-8.

5Quan Y，Xu M，Cui P，etal.Grainyhead-like 2 promotes tumor growth and is associated with poor prognosis in colorectal cancer〔J〕.J Cancer，2015；6(4)：342-50.

6Dong H，Zhu G，Tamada K，etal.B7-H1，a third member of the B7 family，co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion〔J〕.Nat Med，1999；5(12)：1365-9.

7Eppihimer MJ，Gunn J，Freeman GJ，etal.Expression and regulation of the PD-L1 immunoinhibitory molecule on microvascular endothelial cells〔J〕.Microcirculation，2002；9(2)：133-45.

8Shi SJ，Wang LJ，Wang GD，etal.B7-H1 expression is associated with poor prognosis in colorectal carcinoma and regulates the proliferation and invasion of HCT116 colorectal cancer cells〔J〕.PLoS One，2013；8(10)：e76012.

9Hirano F，Kaneko K，Tamura H，etal.Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity〔J〕.Cancer Res，2005；65(3)：1089-96.

10Keir ME，Butte MJ，Freeman GJ，etal.PD-1 and its ligands in tolerance and immunity〔J〕.Annu Rev Immunol，2008；26：677-704.

11Dong H，Strome SE，Salomao DR，etal.Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis：a potential mechanism of immune evasion〔J〕.Nat Med，2002；8(8)：793-800.

〔2015-08-17修回〕

(編輯滕欣航)

〔中圖分類號〕R735

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1832-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.018

基金項目：四川省衛計委項目(140030)

第一作者：黎靖(1970-)，男，副主任醫師，主要從事肝膽胰疾病基礎和臨床方向研究。