生物燃料生產中微生物的有機溶劑耐受機制

曹小龍，田 云，盧向陽

（1．湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙410028；2．湖南省農業生物工程研究所，湖南 長沙410028）

面對能源日益枯竭、環境不斷惡化、溫室效應日趨嚴重等問題，綠色可持續發展的生物能源受到了廣泛重視，其中燃料乙醇被公認為是最有發展前景的可再生清潔能源之一。木質纖維素是燃料乙醇生產中最具潛力的原材料，其轉化生成生物燃料的過程主要分為3步：預處理、糖化和發酵，其中最重要也最困難的是糖化過程，即將致密的生物質原材料分解為可發酵的還原性單糖。預處理方法主要有酸水解、堿水解、蒸汽爆破法、超聲波破碎法、氨纖維爆破法等。

預處理雖然可以很好地降低纖維素聚合度，但會產生很多對細胞有毒害作用的物質，主要有以下3類：（1）弱酸，包括乙酸、甲酸、乙酰丙酸等；（2）呋喃醛類，主要是糠醛和羥甲基糠醛；（3）酚類化合物［1］。除了預處理過程產生的有毒物質外，發酵產物的積累也會對細菌產生一定的毒害作用，最終降低生物燃料的產量。有機溶劑毒性主要體現在：提高了細胞膜的滲透性和流動性，降低了能量轉移勢，破壞了膜蛋白的功能等等［2］。當細胞膜的滲透性提高時，細胞內pH值控制受到影響，胞內大分子（如RNA、磷脂和蛋白質）向外滲透，嚴重威脅細胞的生長及存活；細胞膜流動性的提高會改變其結構和穩定性，能量勢的降低則直接影響到各項生理活動的正常進行，甚至導致細胞死亡。有機溶劑的毒性大小與其極性密切相關，logP值在1～4之間的有機溶劑易溶于水，易進入細胞膜，對細胞危害極大［3］。

當外界環境中存在有機溶劑時，非耐受菌細胞膜會遭到破壞，生理功能受到影響，甚至死亡，耐受菌則會作出相應的改變來適應這種環境［2］。微生物耐受性的研究，對生物燃料生產、生物醫藥開發、環境污染治理等都有著巨大的應用價值。作者在此重點介紹微生物對有機溶劑的耐受機制，包括細胞膜的改變與修飾、輸出泵的作用、熱激蛋白、轉化和降解等等。

1 細胞膜的改變與修飾

細胞膜作為屏障在維持細胞內環境的穩態、保持細菌的正常代謝、在細胞與環境之間進行物質運輸、能量交換和信息傳遞的過程中起著決定性的作用。研究表明，在微生物耐受性方面，細胞膜發揮著關鍵作用，主要機制有：脂肪酸飽和度的增加、脂肪酸極性頭部基團的改變、不飽和脂肪酸的順反異構變化、長鏈脂肪酸含量增加、新合成一些正常條件下不能合成的脂肪酸等。

1．1 脂肪酸飽和度的變化

飽和脂肪酸相對于不飽和脂肪酸有更高的相轉變溫度，因此，細胞膜中飽和脂肪酸含量以及酯?；脑黾樱梢蕴岣吣さ姆€定性［4］。侯雪丹等［5］從釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）出發，篩選獲得乙醇耐受菌株 Y－c－8和丙酮耐受菌株 B－g－5，分析發現 Y－c－8中油酸和亞油酸含量從出發菌的19．24%和0%提高到了26．69%和48．90%，B－g－5中油酸和亞油酸含量分別高達21．87%和52．57%。楊潔等［6］用LC－MS方法分析乙醇發酵過程中釀酒酵母的總磷脂的變化情況時發現，隨著酵母細胞由調整期進入對數期，含有不飽和長鏈的磷脂分子含量減少，含有飽和短鏈的磷脂分子含量顯著增加。Oh等［7］在Escherichia coli基因中敲除一個參與飽和脂肪酸降解和不飽和脂肪酸合成的基因fad的抑制基因fadR，發現細胞膜上各種飽和脂肪酸含量都大幅增加，耐受性也相應地得到了提高。通常認為：飽和脂肪酸的增加可以降低細胞膜的流動性，有利于細胞膜的穩定，對提高細胞的耐受能力有很好的作用。但飽和脂肪酸的合成需要從頭開始，并且是一個耗能的過程［8］，因此，脂肪酸飽和度的改變，被認為是一種微生物耐受有機溶劑的長期機制。另外，個別情況下，脂肪酸飽和度的增加提高了細胞的耐受性，但其乙醇產量并沒有相應提高，說明耐受性和乙醇產量并非簡單的線性關系［9］。

1．2 脂肪酸極性頭部基團的變化

在革蘭氏陰性菌中，磷脂極性頭部基團的種類和與之相連的脂肪酸長度都會影響到細胞膜的流動性。脂肪酸的磷脂極性頭部基團主要有磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸和心磷脂3種，且每一種的相轉變溫度不同，其中心磷脂的最高，在細胞膜中最穩定。磷脂極性頭部基團的改變在P．putida中比較普遍。溶劑耐受菌P．putida DOT－T1E經過甲苯耐受處理后，心磷脂含量從12%上升到25%，磷脂酰乙醇胺含量從78%下降到63%，磷脂酰絲氨酸含量基本保持不變，同位素示蹤法發現90%的32P整合到心磷脂中［10］。而且，有機溶劑的logP值越低，心磷脂的含量越高，磷脂酰乙醇胺的含量越低［11］。由此可以推斷，當遭遇高有機溶劑環境時，細胞膜上磷脂中穩定性高的極性基團含量增加，穩定性低的極性基團含量減少，最終提高了細胞膜的穩定性。

1．3 不飽和脂肪酸的順反異構變化

在細胞膜中，順式和反式不飽和脂肪酸以一定的比例存在著，而且順式不飽和脂肪酸的含量遠大于反式脂肪酸。在順式不飽和脂肪酸中，雙鍵兩側的?；湂A角較大，使膜脂排列相對疏松；而在反式不飽和脂肪酸中，?；湂A角很小，細胞膜排列緊密、有序，有較強的穩定性，可以很好地阻止溶劑進入膜內。在有機溶劑刺激下，通過順反異構酶（cti）的催化將不飽和脂肪酸由順式轉變為反式，可以降低細胞膜的流動性和提高溶劑耐受性［2］。Bernal等通過熒光偏振實驗發現cti基因缺陷突變株的細胞膜致密性不及野生型，而且該基因是單順反子，在對數期和穩定期的表達水平都比較低［12］。還有研究發現，在培養基中加入甲苯后，溶劑耐受菌P．putida DOT－T1E在1min內即發生順反異構，與加入甲苯前相比，最終順反脂肪酸比例從7．5下降到了1［10］。

順反異構是一個不需耗能的反應，能夠迅速有效地進行，因此，其很可能是細胞耐受機制中最先起反應的過程。有人發現順反異構現象在其它環境（如重金屬、高溫、低pH值等）下也普遍出現，說明這種機制可能是細胞應對脅迫的一般防御機制［11］。

2 輸出泵的作用

細胞膜作為細胞的第一道防御屏障，并不能阻擋所有的有機溶劑，當溶劑進入細胞后，會產生相應的破壞作用，面對這種情況，耐受性微生物會通過與能量偶聯的輸出泵機制將胞內的溶劑排出，保證其正常的生理環境，該現象普遍出現在革蘭氏陰性菌中。

輸出泵是能利用質子動力勢將胞內溶劑排出的膜蛋白，由3個功能不同的部分組成，內膜蛋白負責底物識別和質子逆轉運，胞質連接作為內膜泵之間的橋梁，外膜蛋白作為輸出通道，三者缺一不可［2］。目前，已經發現大量功能各異的輸出泵，這些輸出泵能將包括丁醇、甲苯、苯乙烯、己烷、庚烷、辛烷、抗生素和其它烴類在內的多種物質排出胞外，并提高細菌的耐受性。當前研究得最透徹的是RND家族（Resistance－nodulation－division family）的輸出泵，例如，P．putida DOTT1E的3個輸出泵（TtgABC、TtgDEF和TtgGHI）能有效地從細胞膜上泵出甲苯、苯乙烯、乙基苯和丙基苯4種溶劑［13］；來自大腸桿菌的輸出泵acrAB－tolC能夠將己烷、庚烷、辛烷和壬烷等排出胞外［14］；任靜朝等［15］在志賀菌中也發現了輸出泵acrAB－tolC，并證實了該輸出泵能很好地將某些有機溶劑和抗生素排出胞外。

利用基因手段構建工程菌，對于提高細菌的耐受性和燃料產量是非常有前景的。Dunlop等［16］利用生物信息學方法，在數據庫中發掘到了43個輸出泵基因，并將其在大腸桿菌中表達，用7種常見的有機溶劑分別測試其耐受性，發現43株工程菌對丁醇和異戊醇的耐受性都沒改變，而對其它5種（Geranyl acetate，Geraniol，α－Pinene，Limonene，Farnesyl hexanoate）有機溶劑的耐受性均有顯著提高，且生物燃料產量也大幅提高。

3 熱激蛋白

熱激蛋白（Heat shock proteins，HSP）也被稱作分子伴侶，是細胞在外界物理化學刺激下產生的一類蛋白質，在胞內蛋白質的合成、轉運、折疊和降解過程中起重要作用［17］。按照蛋白的大小，可分為5類，分別為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60以及小分子熱激蛋白［18］。熱激蛋白最先是在果蠅中發現的，受熱刺激后合成量顯著增加，之后，發現其還能受溶劑、紫外線、機械損傷等誘導。

熱激蛋白在溶劑脅迫下，能夠阻止蛋白質聚集，并協助其重新折疊，并最終提高耐受性［2］。目前，已經在大腸桿菌、乳球桿菌、芽孢桿菌、假單胞菌、釀酒酵母等微生物中發現了熱激蛋白的存在，而且不斷有人通過基因工程手段將熱激蛋白基因轉入溶劑生產菌中成功構建溶劑耐受菌。Tomas等［19］發現熱激蛋白Gro－ESL過表達可以降低丁醇對C．acetobutylicum的抑制，后續實驗也證實GroESL過表達可以引起一系列熱激蛋白基因（包括dnaKJ、hsp18、hsp90）表達的提高。Zingaro等［20］在大腸桿菌中插入熱激蛋白基因構建各種半合成脅迫應答系統，同時超表達熱激蛋白GrpE和GroESL后，工程菌在5%（體積分數，下同）乙醇中24h后的活力是出發菌的3倍；同時超表達GroESL和ClpB共存質粒后，工程菌在5%乙醇、1%正丁醇和1%異丁醇中24h后的活力較出發菌分別提高了1130%、78%和25%；同時超表達GrpE、Gro－ESL和ClpB的單質粒后，工程菌在7%乙醇、1%正丁醇和25%1，2，4－丁三醇中24h后的活力較出發菌分別提高了200%、390%和78%。這些均表明熱激蛋白在微生物耐受性方面發揮著巨大的作用。

熱激蛋白基因的表達往往受特定的轉錄因子和σ因子的調控，其中最重要的是革蘭氏陰性菌中的σB和芽孢桿菌中的σS，但其具體調控機制還不清楚［17］?？偟膩碚f，熱激蛋白可以通過修復損傷蛋白質而起到提高細胞耐受性對抗細胞死亡的作用，并且能有效提高生物燃料產量。

4 轉化與降解

在有毒溶劑進入細胞后，細胞還會產生相應的酶系，將有毒溶劑降解為低毒或無毒的小分子物質，排出胞外或加以利用。P．putida DOT－T1E可以在90%（體積分數）的甲苯培養基中生存，主要是因為胞內甲苯雙加氧酶將甲苯氧化成了3－甲基兒茶酚，并最終進入檸檬酸循環，通過降解甲苯，消除抑制作用，從而維持正常的生理代謝［12］。最近，Dai等［21］在 Clostridium acetobutylicumRh8菌株基因組中插入一個來自ClostridiumbeijerinckiiNRRL B593的次級醇脫氫酶基因（sADH），由thl啟動子控制，發現該基因過表達后，Rh8的醇耐受性顯著提高，而且在以31．42%葡萄糖發酵過程中，總醇的產量也提高至23．88g·L－1（異丙醇7．6g·L－1、丁醇15g·L－1、乙醇1．28g·L－1）。這表明，相應的降解酶系可以提高微生物對有機溶劑的耐受能力，并最終提高生物燃料的產量，同時，也證明了基因工程手段在提高微生物耐受性的應用中意義重大。

5 其它耐受機制

除了以上這些研究得較多的耐受機制外，耐受微生物中還存在一些報道較少的機制，像比表面積的改變、囊泡外排、脂多糖等。Neumann等［22］報道耐受菌P．putida P8在芳香族化合物（如苯酚、4－氯苯酚）存在時，其細胞體積明顯增大，且溶劑濃度越大，體積變化越顯著，同樣的情況在Enterobacter sp．VKG H12遇到正丁醇時也能觀察到。這說明，在遇到溶劑脅迫時，細胞能夠通過降低其比表面積以減少溶劑對胞體的傷害。另外，Kobayashi等［23］發現 P．putida IH－2000在加有甲苯的培養基上生長時，會產生大量的囊泡，且囊泡會從細胞膜上釋放出來，囊泡中的甲苯濃度遠高于細胞膜上的甲苯濃度，說明該菌通過形成囊泡將胞內的有毒溶劑排出胞外。

微生物體內存在多種耐受機制，這些機制往往不是單獨起作用，而是多種機制共同作用以應付復雜的生存環境。Sandoval等［24］分別取有機溶劑存在時和不存在時的大腸桿菌基因組構建文庫，分析后發現一系列與細胞膜和胞外進程相關的基因表達發生了變化，并產生特異的氨基酸和核苷酸，表明耐受性涉及多條途徑。多種耐受機制的存在，使細胞對溶劑的耐受性大大提高，保持了菌株的活性，一定程度上也提高了生物燃料的終產量。

6 結語

在生物燃料的生產過程中，產物的積累會抑制微生物和酶的活性，并最終影響其產量，應對措施主要有兩個方面：一是及時從反應器中除去產物以解除抑制作用，其方法主要包括氣提、液提、滲透蒸發、滲透萃取等；二是通過菌種篩選、菌種馴化、誘變、基因改造等方法提高菌種的耐受能力，使之能在高濃度的有機溶劑條件下正常生長。微生物的有機溶劑耐受機制多種多樣，主要分為通過細胞膜的防御作用阻止毒性溶劑的進入、通過輸出泵將已經進入胞內的溶劑排出、通過胞內降解酶系將未能及時排出的有毒溶劑分解等三個方面，因此，提高微生物有機溶劑耐受性的方法也可以從針對這三個方面著手，包括從高濃度溶劑污染的自然環境中篩選耐受菌，在宿主菌株中轉入相應的熱激蛋白基因、輸出泵基因、高耐受性脂肪酸膜基因等以構建新的高耐受性的工程菌等。

有機溶劑對微生物的作用并非絕對的，研究發現，在適當的濃度下，有機溶劑也能促進微生物的生長，并最終提高生物燃料產量。例如，法尼烯等生化柴油和脂肪酸衍生物燃料在適當的濃度下不會抑制細胞的生長［2］；在釀酒酵母乙醇發酵過程中，低濃度的弱酸（＜100mmol·L－1）甚至可以提高乙醇得率，而在高于這一濃度時，乙醇得率則會降低［25］。

高有機溶劑耐受能力的菌株在生物燃料生產、生物修復、生物醫藥、污水處理、酶制劑開發、全細胞生物催化等領域有著巨大的應用價值，但溶劑輸出泵的具體作用機制、革蘭氏陽性菌的耐受機制等相關研究都還需要進一步的深入。

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