噬菌體控制主要食源性致病菌的研究進展

曹振輝，金禮吉，徐永平,*，李淑英，張建城，馬永生，李化強，曹 放，楊 揚

(1.大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024；2.云南農業大學動物科學技術學院，云南 昆明 650201；3.大連理工大學 動物性食品安全保障技術教育部工程研究中心，遼寧 大連 116600；4.大連賽姆生物工程技術公司博士后工作站，遼寧 大連 116600)

噬菌體由Twort于1915年、D’Hérelle于1917年相繼發現，是一種可以感染細菌的病毒。裂解性噬菌體(以下簡稱噬菌體)在感染細菌后，能引起宿主細胞破裂，利用這一特性可以將噬菌體應用于抗菌治療。在抗生素發現并廣泛應用之前，人們就已開始嘗試應用噬菌體防治細菌感染，并取得了一系列可喜的成果。自20世紀40年代，由于抗生素實現大規模工業化生產及推廣以后，除了前蘇聯和少數東歐國家，歐美等發達國家噬菌體的抗菌研究曾一度中斷。然而，進入20世紀70—80年代，隨著細菌耐藥性問題和20世紀90年代以來食品安全事件頻頻發生，特別是超級細菌的出現，應用抗生素進行抗菌治療面臨著巨大挑戰，有關將噬菌體作為抗菌制劑的研究又開始受到普遍關注。大量研究顯示，噬菌體已經成功地應用于人、家畜、水產養殖動物以及農作物細菌性感染的防治，并在食品保鮮和抗微生物污染方面彰顯優勢。

在食品生產過程中，抗生素的濫用及過量使用導致了廣譜耐藥性食源性致病菌大量出現，由其所引起的食源性疾病已成為當今世界上最廣泛的公共衛生問題之一。引起食源性疾病的主要病原微生物有沙門氏菌(Salmonella)、彎曲桿菌(Campylobacter)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、大腸桿菌O157：H7(Escherichia coli O157：H7)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[1]。目前應用噬菌體防治食源性細菌疾病已取得重要進展，本文就噬菌體對上述病原微生物的抗菌作用進行綜述，以期為噬菌體及其制劑在保障動物性食品安全領域的深入研究提供參考。

1 噬菌體作為抗菌制劑的優勢

與傳統的抗生素療法相比，噬菌體控制食源性疾病致病菌主要有以下優勢：1)特異性強。噬菌體具有較強的特異性，特異性可以精確到種、甚至株，只特異性地感染相應的致病菌。通過以致病菌為宿主選擇性地篩選其特異性噬菌體，不會干擾人或動物體內正常菌群，不會破壞環境(食品基質)中固有的微生物群落而導致微生態失衡[2]。2)自我增殖性。在適當的條件下，每一個裂解周期內，噬菌體以指數方式增殖，施用劑量得到迅速放大，抗菌有效性增強，在治療細菌感染中起到至關重要的作用[3]。3)對耐藥菌株的再侵染性。某一種噬菌體抗性菌株可以被其他具有類似抗菌譜的噬菌體感染而裂解[4]；另外，某些噬菌體還可以隨著抗性菌株的產生而變異，可以重新裂解變異菌株。且通過多種噬菌體混合制成的雞尾酒制劑，可以避免致病菌對單一噬菌體產生的抗性[5]。4)安全性較高。噬菌體由蛋白質和核酸組成，降解后的終產物是氨基酸和核酸片斷，對人或動物來講不是化學藥物等異型物質，噬菌體進入人或動物體內的代謝過程可被視為自然過程[6]；在人或動物體的胃腸道區域[7]以及新鮮的雞肉、豬肉、牛肉及加工的熟食[8-9]中都發現有噬菌體存在。因此，對于人或動物來講，噬菌體并非異源物質。5)自然界存在廣泛，物種豐富。噬菌體分布極廣，凡是有細菌的場所，就可能有相應噬菌體的存在。在人和動物的排泄物、污染的井水、河水以及土壤中，都可分離特異性噬菌體。水和土壤中的噬菌體數量大約是細菌數量的10～100倍，推測噬菌體在地球上的豐度約為1031[10]。6)研發時間短，成本低。篩選新的噬菌體治療耐噬菌體的細菌感染，時間相對較短，通?？稍跀堤旎驍抵苤畠韧瓿桑疫M化論認為通過自然選擇的不斷篩選，噬菌體能夠治療耐抗生素和耐噬菌體的細菌感染[4]。

2 噬菌體控制食源性病原微生物

2.1 沙門氏菌

沙門氏菌是一種革蘭陰性桿菌，兼性厭氧，具有復雜的抗原結構，一般可分為表面抗原(Vi抗原)、菌體抗原(O抗原)和鞭毛抗原(H抗原)。沙門氏菌病是世界上最為常見的一種食源性疾病，在我國因該致病菌引起的食物中毒居首位。家禽尤其是仔雞是沙門氏菌人畜共患病原菌的主要寄生場所和傳染源[11]。

B o r i e 等[12]研究了混和噬菌體制劑對仔雞腸炎沙門氏菌的腸道定殖的影響，在接種腸炎沙門氏菌(9.6×105CFU/mL)前24h，以粗噴霧和飲用水的形式施用3株噬菌體(感染復數為103)的混合制劑，結果顯示，噴霧形式顯著降低了雞群沙門氏菌感染率，兩種使用方式均可顯著降低腸道腸炎沙門氏菌的定殖。Atterbury等[13]從養雞場、屠宰場及廢水中分離得到232個噬菌體，宿主譜實驗表明其中3株噬菌體對腸炎、Hadar及鼠傷寒沙門氏菌3個血清型具有裂解作用；分別使用上述3種血清型沙門氏菌感染肉用仔雞，觀察噬菌體對不同血清型沙門氏菌定殖的影響，結果表明與對照組相比，24h內第1、2株噬菌體分別降低了盲腸內腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌4.2、2.19(lg(CFU/g))，而較高效價的第3株噬菌體提高了Hadar血清型沙門氏菌的抗性比例，未能影響其定殖。Sklar等[14]以抗萘啶酮酸腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)攻毒仔雞為研究對象作了類似的研究，揭示除了細菌的噬菌體抗性以外，噬菌體的施用方式、環境以及不同的動物個體等因素可能會影響到噬菌體的抑菌效果。Higgins等[15]考察了噬菌體對雞胴體腸炎沙門氏菌的抑菌效果，實驗中選用人工污染致病菌的肉雞胴體和自然感染致病菌的火雞胴體作為實驗對象，通過噴灑和浸泡的方式施用噬菌體，結果顯示高濃度的單一噬菌體和多種噬菌體的混合制劑均能顯著降低胴體的染菌率，同時向肉雞屠宰場的污水中添加噬菌體可以顯著降低污水中的腸炎沙門氏菌濃度；另外，研究人員發現與空白對照組相比，噬菌體Felix 01野生型及其突變型分別顯著降低了法蘭克福雞肉香腸中的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)1.8 、2.1(lg(CFU/g))，而兩者之間無顯著差異[16]。以上研究表明，選擇合適的噬菌體和優化噬菌體不同的給予方法、劑量和時間是噬菌體控制沙門氏菌的關鍵因素。

2.2 彎曲桿菌

彎曲桿菌是世界范圍內引起人類急性腹瀉的最常見的致病菌。在發達國家，空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)和大腸彎曲菌(Campylobacter coli)是引起急性細菌性腸炎的主要病原菌之一。禽類(尤其是雞)是彎曲桿菌的主要宿主和傳染源，食用被彎曲桿菌污染的禽肉是該致病菌的主要傳播途徑。

Atterbury等[17]從22個雞場90個雞群中采集了205個羅斯肉用仔雞樣品，采集盲腸樣品檢測噬菌體和空腸彎曲桿菌的數量，發現空腸彎曲桿菌及其噬菌體的檢出率分別為63%和20%，噬菌體陽性樣品中的致病菌的數量5.1(lg(CFU/g))顯著低于噬菌體陰性樣品6.9(lg(CFU/g))；噬菌體陽性、陰性樣品中空腸彎曲桿菌陰性率分別為71%、20%；表明盲腸處的噬菌體與空腸彎曲桿菌的存在呈現負相關性，噬菌體的存在影響了致病菌在盲腸中定殖。Loc Carrillo等[18]研究了2株廣譜噬菌體控制雞感染空腸彎曲桿菌的效果，結果表明分別口服一定濃度的噬菌體可以減少空腸彎曲桿菌在雞體內定殖的數量，另外，雖然噬菌體療法可以引發抗性菌株的出現，但這些抗性菌株的定殖能力已有所下降，且能夠被噬菌體再感染。Atterbury等[19]在空腸彎曲桿菌NCTC12662 PT14感染雞皮后30min接種噬菌體Φ2，4℃冷藏，進一步深入研究了特異性噬菌體Φ2對人工感染雞皮的空腸彎曲桿菌抑菌效果。結果顯示，與對照組相比，5×106PFU/cm2的噬菌體接種量在所有的取樣點(1、3、5d)均極顯著降低了致病菌(接種量為5×105、5×103CFU/cm2)的感染量，同時證實了噬菌體廣泛存在于家禽制品中，因此，對于家禽制品，應用噬菌體作為生物抗菌劑，是一種非外源物質的安全制劑[20]。隨著我國雞肉消費量的增長，沙門氏菌、彎曲桿菌食源性疾病的發病率不斷增高。綜上所述，噬菌體療法降低雞飼養過程中沙門氏菌、彎曲桿菌在腸道的定殖，從而可以降低屠宰加工過程中兩種致病菌進入人類食物鏈的風險。

2.3 單核細胞增生李斯特菌

單核細胞增生李斯特菌，簡稱李斯特菌，是重要的食源性致病菌之一，老人、嬰兒、孕婦和免疫能力低下的成年人特別容易受其感染。該致病菌廣泛存在于食品原材料和食品加工環境中，由于其能在低溫條件下存活，因此該致病菌可以廣泛污染冷藏保存的即食食品。

Guenther等[21]研究了噬菌體A511、P100對于即食食品中人工感染Scott A、WSLC1001李斯特菌的抑菌作用，所選用的即食食品包括液體食品(巧克力奶和Mozzarella 干酪)和固體食品(熱狗、火雞切片肉、熏制的三文魚、海鮮等)。結果顯示，人工接種1×103CFU/g李斯特菌后，添加3×108PFU/g的噬菌體，6℃貯藏6d后，液體食品的染菌量迅速降低至直接檢測法的檢測靈敏度以下， 固體食品的染菌量也得到有效降低，降幅最大可達1×105CFU/g；6℃、13d或20℃、6d的貯藏條件，噬菌體依然表現出相同的抑菌效果；且高劑量的噬菌體(3×108PFU/g)抑菌效果顯著高于低劑量(3×107、3×106PFU/g)，證實寬宿主譜的裂解性噬菌體A511、P100均能有效控制即食食品中污染的李斯特菌，且高劑量的噬菌體可通過擴散而非自我復制的方式，增加噬菌體接觸到宿主菌的機會。Carlton等[6]對李斯特菌特異性噬菌體P100進行了基因組測序、安全性評價以及其在奶酪中抑菌實驗，結果表明，純化的噬菌體蛋白與李斯特菌及其他產生毒素、致病因子、抗生素耐藥基因、過敏源的細菌基因或蛋白無同源性；對連續5d口服P100噬菌體(5×1011PFU/d)的8周齡維斯塔爾鼠進行毒性、藥理觀察以及病理學檢驗，結果表明8d屠宰后，實驗動物無任何病態或致死性臨床表現以及異常的組織學變化，說明P100可作為食品添加劑而無任何潛在危險；在奶酪實際生產中使用含有噬菌體P100的鹽水沖洗成熟期的奶酪，使奶酪表面攜帶噬菌體，實驗結果表明重復接種噬菌體(終濃度分別為6×107、2×106PFU/cm2)和1次接種高劑量的噬菌體(終濃度6×108PFU/cm2)，均可以顯著降低奶酪(起始濃度2×101CFU/cm2，加工后6℃貯藏5d)中的李斯特菌數量，甚至完全消除該致病菌的污染，且實驗過程中無P100噬菌體抗性菌株產生[6]。綜上所述，噬菌體的接種劑量及頻率均影響噬菌體的抑菌效果，P100噬菌體可作為一種安全、有效的生物制劑控制食品生產及加工設備的李斯特桿菌污染。

2.4 大腸桿菌O157：H7

食源性大腸桿菌O157：H7可通過污染飲水、食品導致疾病暴發流行，引起腸出血性腹瀉，病情嚴重者可危及生命，該病已成為世界性公共衛生問題[22]。牛體及其飼養環境是大腸桿菌O157：H7的主要寄生場所和重要的傳染源。如何消除大腸桿菌O157：H7對食品的污染，減少或切斷病原菌可能的傳播途徑，已成為世界范圍內亟待解決的問題。

鑒此，大連理工大學噬菌體研究小組與加拿大農業部[23]合作共同檢測了4株大腸桿菌O157：H7噬菌體(rV5、wV7、wV8和wV11)的抑菌效果，發現在－2、0、2、6、9d瘤胃插管多次灌喂噬菌體(每劑3.3×1011PFU)，可顯著降低牛大腸桿菌O157：H7(0d時瘤胃插管攻毒劑量為1010CFU)的腸道總排泄量；并揭示了天然存在于動物個體和養殖環境中的大腸桿菌噬菌體均能降低大腸桿菌O157：H7在牛群中的檢出率。Sheng等[24]報道了2株噬菌體SH1、KH1混合制劑對于定殖于公牛直腸肛門連接處的大腸桿菌O157：H7的影響。實驗首先通過直腸給藥的方式接種大腸桿菌O157：H7，7d后給予1010PFU噬菌體混合制劑(感染復數≥100)，此外，在噬菌體處理組的飲水中添加噬菌體(106PFU/mL)，結果顯示，與對照組相比，實驗組直腸肛門連接處的平均病菌濃度顯著降低。O’Flynn等[25]報道了噬菌體抑制牛肉表面大腸桿菌O157：H7的效果，結果7/9的牛肉表面大腸桿菌O157：H7檢測為陰性，2/9的牛肉表面病菌濃度降至10CFU/mL以下。以上研究表明，使用噬菌體的多株混合制劑可顯著降低牛體及牛肉中大腸桿菌O157：H7的數量，從而降低該致病菌的傳播幾率，并且提示在養殖場的環境中施用噬菌體可降低甚至阻斷病原菌在牛群中的傳播，從而在牛肉生產的源頭上保障食品安全。

2.5 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌是世界范圍內又一廣泛流行的食源性致病菌，其分泌的細胞內毒素是引起食物中毒的主要原因[26]。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到。因此，食品受其污染的機會較多。我國每年發生的此類中毒事件約占細菌性食物中毒事件的25%。

Matsuzaki等[27]研究了宿主譜最寬且不含任何毒素和抗生素抗性基因的噬菌體ФMR11對金黃色葡萄球菌的作用效果，結果顯示，當感染復數≥0.1時，該噬菌體能夠清除小鼠體內循環系統中的金黃色葡萄球菌(腹腔注射，接種量為8×108CFU)，小鼠的死亡率顯著降低。而且體外和體內研究均顯示噬菌體可通過致病菌進入巨噬細胞內，有效殺死細胞內的致病菌[28]。Gu等[29]從廢水處理系統中分離得到一種金黃色葡萄球菌噬菌體GH15，并分離得到了其內源性裂解酶(LysGH15)，研究該酶對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的抑菌作用。表明LysGH15在體外能夠殺死金黃色葡萄球菌，體內能有效控制其感染，可作為一種治療方法防控耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。García等[30]對2種從牛奶中分離的金黃色葡萄球菌溫和噬菌體進行DNA隨意切除，獲得了2種裂解性噬菌體ФH88、ФA35，研究了這2種噬菌體的混合制劑對金黃色葡萄球菌的抑制作用。結果顯示，使用2種噬菌體的混合物在感染復數為100時，可以完全消除37℃條件下超高溫全脂乳中的金黃色葡萄球菌(接種量為3×106CFU/mL)，且產生噬菌體抗性菌株的頻率是溫和噬菌體的1/200；在酸奶的制作過程中，接種1×106CFU/mL 的金黃色葡萄球菌同時添加2種噬菌體的混合制劑，25℃(感染復數為250)和30℃(感染復數為350)的加工條件下，分別在4h后、1h內完全清除了該致病菌。上述研究表明，在動物性食品生產過程中可用金黃色葡萄球菌特異性噬菌體及其裂解酶來消除病原菌污染，提高畜產品品質。

3 噬菌體制劑產品

鑒于噬菌體在控制各種病原菌特別是高耐藥性超級細菌方面的顯著效果，目前，在全球范圍內越來越多的制藥公司參與噬菌體的研究及臨床實驗，對噬菌體療法廣泛關注，并相繼有一些噬菌體制劑產品面世。其中噬菌體研究應用于食品領域且具有重要標志意義的事件包括：2006年，美國食品藥品監督管理局(FDA)批準ListShieldTM噬菌體產品可作為食品添加劑，用于即食食品和禽肉制品中控制單核細胞增生李斯特菌污染；2007年，FDA又批準了另外1株李斯特菌噬菌體為公認安全添加劑(GRAS)，可以添加到奶酪等其他食品中；2011年，FDA批準了EcoShieldTM產品可應用于紅碎肉中降低大腸桿菌O157：H7污染。可見，隨著分子生物學及噬菌體技術的發展，越來越多的噬菌體將會被開發成商品，用于病原菌控制的各個領域。

4 結 語

沙門氏菌、彎曲桿菌、李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等引起食源性疾病的主要病原微生物嚴重威脅著人類健康，造成了巨大的經濟損失。利用裂解性噬菌體的殺菌特性，在從農場到餐桌的全產業鏈中抑制上述病原菌的傳播，已成為食品安全領域的重要研究內容之一。研究表明，在動物性食品生產、加工或貯藏過程中應用噬菌體可以有效地降低或消除病原菌的污染。但噬菌體抗菌的可靠性和安全性仍有待于深入研究和進一步驗證，諸如：1)在動物屠宰前，在養殖環境條件下應用噬菌體控制策略的效果不盡一致，因此基于活畜水平的農場控制策略需通過篩選新型高效(裂解能力強和宿主譜寬)噬菌體，并優化施用條件及闡明噬菌體與宿主間的相互作用的動力學原理；2)現有研究結果大多是建立于實驗室，通過人工接種致病菌的方法研究噬菌體的作用效果，噬菌體抗菌策略能否在實際生產條件下控制致病菌對動物性食品的污染需要進一步評價和驗證；3)在動物屠宰后食品加工環節應用噬菌體控制病原菌的傳播，應根據不同食品基質的不同成分、化學特性及加工過程開展具體研究。

總之，噬菌體具有特異性強、自我增殖快、篩選周期短等抗生素無法比擬的優點，具有成為新一代天然、綠色、安全抗菌制劑的可能性。并且，隨著生物工程技術的快速發展以及現代生物技術研究手段的不斷進步，今后噬菌體控制病原菌的策略和技術會得到完善和突破，并最終替代傳統抗生素用于控制食源性致病菌，保障食品安全，保護人類健康。

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