鴉膽子油乳注射液靜脈給藥長期毒性實驗研究

隋蓮翠，戴學棟

（1.煙臺市萊陽中心醫院功能科，山東 萊陽 265200；2.山東省醫藥工業研究所，山東 濟南 250033）

鴉膽子為苦木科植物鴉膽子的成熟果實，其主要成分是鴉膽子苦素、鴉膽子苦內酯、鴉膽子苦醇、糖甙等，單獨應用可以抗癌[1-4]。鴉膽子油乳是以鴉膽子石油醚提取物為原料，以精制大豆磷脂為乳化劑制成的水包油乳劑，臨床上鴉膽子油乳已廣泛應用于肺癌、肝癌、食道癌等多種惡性腫瘤的治療[5-6]。鴉膽子油乳注射液主要成分為甘油、精制豆磷脂和精制鴉膽子油，為鴉膽子油與乳化劑制成的滅菌乳狀液體[7-8]。為探討鴉膽子油乳注射液靜脈注射的安全性，本文對其進行了長期毒性研究。

1 材料與儀器

1.1 藥物配制 將鴉膽子油乳注射液用0.9%氯化鈉注射液稀釋成高、中、低三種不同劑量的溶液。在每次用藥前新鮮配制，將配制好后的藥物用牛皮紙包裝的容器保存。

1.2 試劑 實驗所用的試劑主要有燦爛甲酚蘭（批號：99-01-23，規格：10 g，上海化學試劑采購供應站試劑廠）、檸檬酸三鈉（批號：20080624，規格：500 g，山東博山化學試劑廠）、乙二胺四乙酸二鉀鹽（批號：20070605，規格：100 g，中國醫藥集團上海化學試劑公司）、戊巴比妥鈉（批號：090205，規格：25 g，濟南誠言科技有限公司）、40%甲醛（批號：20100522，規格：500 ml，萊陽市康德化工有限公司）。

1.3 儀器設備 實驗所用的主要儀器設備有HEMAVET-950型全自動血球計數儀，BS300型生化分析儀，C2000型血凝儀，S-2000型電解質分析儀，TDL-5臺式低速大容量離心機，TIGE-1220型電子臺秤，AY-220型電子分析天平，YB-502型電子天平，病理所用儀器（包含TB-718包埋機、NP-B包埋機、TK-218攤烤片機）、TP1020生物組織脫水機、RM2235切片機。

1.4 實驗動物 選用長期毒性實驗常用動物SD大鼠，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，所用動物數量符合統計學和實驗的要求。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組 實驗動物共設四組，從檢疫適應7 d的大鼠中挑選160只，隨機分為高、中、低劑量組和對照組，每組40只大鼠，雌雄各半。

2.2 給藥劑量 考慮到鴉膽子油乳的毒性及給藥周期，將給藥劑量設計為：高劑量組為10ml·kg-1·d-1，約相當于臨床日最大用量的23倍；中劑量組為高劑量的1/3，為3.3 ml·kg-1·d-1，約相當于臨床日最大用量的8倍；低劑量組為中劑量的1/3，為1.0 ml·kg-1·d-1，約相當于臨床日最大用量的2.3倍，對照組為給予等容積的0.9%氯化鈉注射液。

2.3 實驗步驟 每天給動物靜脈給藥1次，每周給藥6 d，連續給藥26周，給藥容積為20 ml/kg。每日觀察動物的外觀體征、行為活動、呼吸情況、食欲情況和給藥局部反應等。給藥13周時，每組各取10只動物；給藥26周時，每組各取20只動物；恢復期結束后取剩余所有動物，隔夜禁食11～14 h，將每只動物腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉后，先對動物進行外觀檢查，包括動物的一般外觀檢查、體內各臟器、體液等的肉眼觀察。肉眼觀察后進行取血，取血后進行剖檢。摘取部分臟器用4%甲醛溶液固定后，用RM2235切片機制備2～3μm厚切片，用蘇木素伊紅進行染色，并用顯微鏡觀察。

2.4 檢測項目 血液學檢查主要指標包括：紅細胞計數(RBC)、紅細胞容積(HCT)、平均紅細胞容積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)、血紅蛋白濃度(HB)、白細胞計數(WBC)及分類、血小板（PLT）、網織紅細胞百分含量（NRBC%）等14項指標。血液生化學檢查主要指標包括：丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽固醇(TC)、總蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、甘油三酯(TG)、血糖(GLU)、鈉(Na+)等15項指標。病理檢查主要包括：腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮、垂體等30個臟器或組織。

2.5 統計學方法 實驗數據采用DAS 1.0中長毒指標統計進行分析，將各項指標以均數±標準差(±s)表示，將各劑量組與對照組的各項指標進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 實驗結果

3.1.1 一般觀察指標 實驗期間，鴉膽子油乳注射液高劑量組有3只大鼠死亡，死亡率為7.5%。鴉膽子油乳注射液中、低劑量組及對照組均無大鼠死亡。對照組、中、低劑量組以及高劑量組存活大鼠未見明顯異常反應。

3.1.2 血液學指標 將高劑量組與同期同性別對照組大鼠比較發現：給藥26周時，高劑量組雌性大鼠 MCV(t值為 3.096)、RDW(t值為 4.211)和NRBC%(t值為4.282)等指標明顯升高(P＜0.01)，PLT指標(t值為2.432)明顯降低(P＜0.05)；高劑量組雄性大鼠RBC指標(t值為2.232)明顯降低(P＜0.05)，RDW（t值為6.587）、NRBC%(t值為4.747)等指標明顯增大(P＜0.01)。高劑量組大鼠的其他血液學指標及中、低劑量組大鼠在各時期檢查的全部血液學指標與同時期同性別對照組大鼠進行比較，發現組間差異無統計學意義(P＞0.05)。

3.1.3 血液生化學指標 將高劑量組與同期同性別對照組大鼠比較發現：給藥26周時，高劑量組雌性大鼠血液BUN指標（t值為2.293）明顯升高(P＜0.05)，Na+含量（t值為2.337）略有升高(P＜0.05)，低劑量組雌性大鼠血液Na+含量（t值為2.329）略有升高(P＜0.05)，但Na+的升高均不是很明顯，在正常的生理范圍內。可以認為Na+的升高僅有統計學意義，無生理學意義，與藥物的毒性無關。高劑量組大鼠的其他血液生化學指標及中、低劑量組大鼠在各時期檢查的全部血液生化學指標與同時期同性別對照組大鼠進行比較，發現組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

3.1.4 病理學觀察 高劑量組死亡大鼠肝臟、中央靜脈及肝血竇擴張并有瘀血，肝細胞呈灶性壞死，肺臟肺泡壁毛細血管擴張充血，肺泡內有大量均質紅染物。中、低劑量組的大鼠未見與藥物相關的病理組織學改變。

3.2 毒性評價

3.2.1 血液學指標 高劑量組大鼠RDW、MCV、NRBC%等指標升高，RBC、PLT等指標降低。RDW變大表明紅細胞形態大小不均，說明鴉膽子油乳注射液高劑量可導致紅細胞形態異常；RBC指標略有減少，但HB和HCT指標無變化，說明紅細胞可能出現破裂或溶解；NRBC%指標增多表明骨髓紅細胞系增生旺盛，判斷為各種增生性貧血引起的失血性貧血。結合以上分析，認為鴉膽子油乳注射液10 ml·kg-1·d-1劑量可能會導致大鼠出現溶血性貧血。實驗中，鴉膽子油乳注射液高、中劑量組大鼠脾臟相對重量增大，可能與紅細胞的溶解和破裂有關。大鼠的溶血性貧血刺激脾臟的濾過功能代償性增加，導致了PLT指標的減少。鴉膽子油乳注射液10 ml·kg-1·d-1劑量對以上紅細胞系及脾臟相對重量的影響在停藥恢復6周后均恢復正常，說明鴉膽子油乳注射液對紅細胞系和脾臟的毒性作用具有可逆性。

3.2.2 血液生化學指標 給藥26周時，鴉膽子油乳注射液10 ml·kg-1·d-1劑量導致雌性大鼠BUN指標明顯升高，表明大鼠的腎臟功能有可能遭到損傷。且高劑量組雌、雄大鼠腎臟相對重量明顯增大。結合以上分析，認為鴉膽子油乳注射液10 ml·kg-1·d-1劑量可導致雌性大鼠腎臟功能出現損傷，但不會導致腎臟出現組織病理學改變。在停藥恢復6周后，高劑量組雌性大鼠BUN指標仍偏高，說明停藥恢復6周后，鴉膽子油乳注射液對大鼠腎功能的損傷仍無法恢復。

3.2.3 病理學結果 鴉膽子油乳注射液高劑量組死亡大鼠肺泡壁毛細血管擴張充血，肺泡內有大量均質紅染物并呈彌散性分布，判斷這兩只大鼠可能死于急性肺水腫。因此，認為該劑量可導致大鼠出現急性肺水腫。

4 討 論

近年來，越來越多的中藥注射劑應用于臨床，改變了傳統的給藥方式，在臨床上發揮著獨特的作用。但隨著其廣泛的應用，中藥注射劑引起的不良反應案例呈現上升趨勢。因此，進行長期毒性實驗，預測藥物可能對人體產生的不良反應，判斷藥物可能的靶器官，推測重復用藥的安全范圍，對安全用藥具有重要的意義。通過實驗觀察大鼠鴉膽子油乳注射液靜脈給藥連續26周后的毒性反應、停藥后的延遲毒性以及可逆性，認為長期靜脈給藥可導致大鼠出現急性肺水腫和溶血性貧血，可能的中毒靶器官為肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、腎上腺及造血系統。綜合分析確定SD大鼠無毒反應劑量為1.0 ml·kg-1·d-1，約為人類臨床劑量的2.3倍。

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