納米羥基磷灰石在膠質瘤治療中的應用進展

郭國財，王 超，姚維成

(青島大學附屬醫院，山東青島266000)

納米羥基磷灰石(nHAP)是一種優質的醫用生物材料，除具有羥基磷灰石(HAP)良好的生物活性及組織相容性外，還有其特性，特別是廣譜的抗癌作用。人腦膠質瘤是最常見的神經系統惡性腫瘤，病死率、復發率高。本文綜述nHAP在膠質瘤治療中的應用進展。

1 膠質瘤的現狀

膠質瘤預后差，近年來發病率有上升的趨勢。有資料顯示，膠質母細胞瘤經確診后1年生存率為30%左右，平均生存期53周左右，手術及放化療后，平均生存期也僅為 14．6 個月左右［1，2］。目前，惡性腦膠質瘤的標準治療方案是手術爭取全切后輔以放療和化療。惡性腦膠質瘤因其浸潤彌漫性生長，或位置深在，或累及重要功能區，往往不能被完全切除。而且，由于多數膠質瘤細胞的基因特性和血腦屏障(BBB)的存在，使放療和化療效果差。近年來，大量的輔助治療方法如基因治療、免疫治療及靶向治療等被應用，并且取得了一定的療效。

2 nHAP的性質

HAP是一種含有氫氧化物離子的磷酸鈣鹽，是人體骨、牙齒無機物的主要成分。HAP與人體骨骼晶體結構基本一致，為六方晶系，呈弱堿性，微溶于水，易溶于酸，難溶于堿。HAP是一種強離子交換劑，分子中的鈣離子容易被鎘、汞、鍶、鋇等金屬離子置換，還可與含有羧基的氨基酸、蛋白質、有機酸等發生反應。HAP的許多特性與其粒徑大小和晶體形態密切相關。

nHAP表現出更優越的性能。nHAP具有溶解度高、均勻分散良好、吸附性強和生物親和性等特質，有更好的生物活性、組織相容性和化學穩定性。大量的生物相容性研究已證實，nHAP無毒、無刺激、不導致過敏反應、不導致溶血、不導致突變、不破壞生物組織，能與骨形成牢固的化學結合，已被廣泛應用于醫用生物材料領域，如硬組織修復材料、藥物及基因載體等。

3 nHAP的抗腫瘤作用機制

Sun等［3］采用液相沉淀法合成nHAP微晶作為抗癌藥物載體，在體外細胞培養實驗中意外發現，nHAP微晶明顯抑制Ca-9癌細胞的增殖，而且，他們還發現nHAP微晶體能夠吸附阿霉素(ADM)、氟尿嘧啶(5-FU)、絲裂霉素C(MMC)等抗腫瘤藥物，作為它們的載體，而ADM和載有ADM的HAP(ADMHAP)對癌細胞均有抑制作用，且后者明顯優于前者［4］。多項研究［5～8］已證實，nHAP 能夠抑制人白血病、骨肉瘤、惡性黑色素瘤、肝癌等多種癌細胞的增殖。目前，研究發現nHAP抗腫瘤作用的機制可能有以下幾個方面。

3．1 nHAP作為化療藥物、基因治療的載體nHAP顆粒小、無毒、無免疫原性、有良好的組織相容性、生物黏附性強，可吸附藥物量大并且能結合、運載大分子藥物，可對插入其中的DNA片斷有很好的保護作用，是一種良好的藥物或基因載體，能夠攜帶抗腫瘤藥物或放射性元素殺滅腫瘤細胞。Itokazu等［9］報道，ADM-HAP作用于骨肉瘤細胞效果較好，ADM緩慢釋出可顯著延長藥物作用時間，能更有效地抑制癌細胞增殖。nHAP可將蛋白類藥物或DNA、RNA等基因治療分子包裹或吸附在其表面，同時也可在顆粒表面偶聯特異性的靶向分子，比如特異性配體、單克隆抗體等，通過靶向分子與細胞表面的特異性受體結合，經細胞吞飲進入細胞內，實現安全有效的靶向藥物治療或基因治療［10］。

3．2 nHAP作用于細胞膜 正常狀態下細胞內Ca2+維持在低水平，腫瘤細胞比正常細胞有更強的鈣攝入能力。nHAP作用于細胞膜，可導致過多的Ca2+攝入，增加細胞內Ca2+濃度，使細胞內鈣穩態失衡，激活細胞內的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內切酶，使 DNA 降解、細胞凋亡［11］。

3．3 nHAP作用于細胞內溶酶體 腫瘤細胞較正常組織細胞有更高的吞噬活性。nHAP溶膠易被吞噬進入細胞，與初級溶酶體結合形成次級溶酶體，在其內降解產生游離酸或者其他細胞毒性產物，導致溶酶體破裂及酶的釋放，從而啟動溶酶體的凋亡途徑，抑制腫瘤生長或直接破壞細胞膜的通透性，導致細胞腫脹、破裂、死亡［12］。

3．4 nHAP影響核酸合成 張建平等［13］采用單細胞凝膠電泳技術，檢測nHAP對大鼠乳腺癌細胞系Walker256的 DNA損傷作用，發現 nHAP可導致DNA鏈形成缺口，阻礙核酸合成，并且作用強度與劑量呈正相關。

3．5 nHAP誘導細胞周期阻滯與凋亡 研究發現，nHAP可能抑制微管、微絲的形成，使癌細胞分化受阻于G2期，并推測，假如nHAP與G2期時相敏感抗癌藥合用，會有化療增敏作用［14］。p53、p21、c-myc等基因和Caspase等是調節細胞凋亡的重要基因，它們控制細胞DNA損傷的應答時序，協調應答過程，通過調節DNA復制、阻斷細胞周期或促進細胞凋亡等程序，引起諸多相關基因的轉錄［15］。p53是一類重要的抑癌基因，主要在G1/S期起控制點作用，它決定細胞是否啟動DNA合成。p53蛋白可上調p21(細胞周期依賴的蛋白激酶抑制劑)表達，阻止細胞分裂，并給細胞提供足夠的時間來修復損傷。c-myc是另一個使細胞由G1期向S期過渡的必要的早期應答基因。研究發現［7］，nHAP能夠上調p53表達，下調c-myc表達，使細胞周期阻滯于G1期。

3．6 nHAP影響端粒酶的活性 端粒酶活性表達是諸多惡性腫瘤獲得無限制生長能力中很重要的環節。端粒酶的主要功能是維持染色體末端的端粒序列，維持染色體的穩定性，抵消因細胞分裂所致的端粒DNA損耗，起到抑制腫瘤細胞的作用。nHAP有抑制腫瘤細胞端粒酶基因表達和下調端粒酶活性的作用［16］。

4 nHAP對腦膠質瘤的治療作用

目前，腦膠質瘤的主要治療方法是手術切除，輔以放化療。但是，腦膠質瘤的基因特性決定了其對放射治療不敏感。而且，血腦屏障(BBB)使絕大多數小分子化合物和幾乎所有的大分子物質不能進入腦病變區，也削弱了化療藥物對腦膠質瘤的療效。

納米粒子轉運藥物不需要開放BBB，允許幾乎所有的藥物被轉運入腦細胞內，且不需要對藥物本身進行修飾;另外，還可用納米控釋系統使藥物緩慢的釋放，維持長時間腦血管藥物濃度，提高療效。沈維高等［17］將負載Stat3 shRNA的nHAP作用于鼠膠質瘤C6細胞，發現其顯著抑制腫癌生長。因此，推測nHAP有望成為腦膠質瘤基因、化學藥物治療的良好載體。

nHAP 本身具有廣譜抗癌作用。田昂等［18，19］應用電化學沉積法在鈦合金表面制備nHAP涂層，與人腦膠質母細胞瘤細胞系U87細胞共培養，發現nHAP涂層能夠很好地抑制U87細胞的增殖，證實了nHAP對膠質瘤具有抑制作用，并且nHAP的不同形態對U87細胞增殖有不同的抑制作用，其中針狀結構抑制作用最強。

研究證實，nHAP只能與TLR+4的單核細胞相互作用。Toll樣受體(TLRs)為Ⅰ型跨膜受體，用來識別和傳導先天性和適應性的免疫反應信號，通過以核因子-κB(NF-κB)為主的刺激信號的級聯反應信號傳導通路，激活多種靶基因，導致細胞因子的釋放和協同刺激因子的表達。膠質瘤是起源于膠質細胞的神經系統腫瘤，膠質細胞在神經系統中行使單核細胞的功能。膠質瘤細胞本身可以表達TLRs［19］，這為nHAP作用于膠質瘤并通過TLRs進行信號傳導提供了理論依據，其機制可能涉及TLR4受體的調控表達［19］。

TLR4是中樞神經系統重要的炎性受體，能夠啟動細胞內信號轉導，通過NF-κB和c-Jun氨基末端激酶(JNK)/應急激活蛋白激酶(SAPK)兩條途徑激活炎性細胞，導致炎性因子TNF-α、IL-6等的大量表達，觸發一系列的炎性反應，可對腫瘤細胞起到抑制作用。Grandjean-Laquerriere等研究發現，nHAP可以誘導 TNF-α、IL-6、IL-10和 IL-18的高表達，上調基質金屬蛋白酶(MMPs)、IL-1b的高表達。但nHAP與膠質瘤細胞TLRs的相互作用及信號傳導途徑還有待進一步研究。

5 nHAP的生物安全性及存在的問題

nHAP具有很好的生物活性和生物相容性，并且能與骨形成緊密的化學結合，作為人工骨材料和組織材料已得到廣泛應用。

郭曉東等通過Ames試驗、微核試驗、急性和亞急性毒性試驗、溶血試驗和凝血試驗，證明nHAP/PDLLA材料沒有毒性，無致突變性和刺激性，不會引起溶血和凝血。劉麗萍等給家兔靜脈注射nHAP，發現致死劑量或接近致死劑量的nHAP，對動物的肝腎功能及酶的影響是一過性的，各項功能均在很短時間內恢復正常，無明顯毒性蓄積。但是，研究發現，nHAP顆粒所組成的溶膠具有一定的不穩定性，隨著存放時間的延長及膠體濃度的增加，nHAP顆粒會出現團聚現象，使顆粒體積增大，甚至超出納米級的范圍。當nHAP顆粒超過毛細血管內徑范圍時，將產生嚴重后果，如果廣泛栓塞肺毛細血管網，導致急性呼吸功能衰竭和右心功能衰竭。

nHAP粒子溶膠的血液相容性研究結果提示，在制備nHAP粒子的時候，應充分考慮粒子的尺寸與分散性可能帶來的生物學效應。另外，nHAP可能會從復合材料中游離出來，并在體內遷移，對生物體產生影響;或者某些成分從nHAP中游離出來，導致nHAP的性能改變，對生物體產生影響。

因此，將nHAP用作靶向藥物載體和抗腫瘤藥物前需要解決以下問題:①nHAP粒子是否容易獲得和均勻分散;②在加載藥物或蛋白質等處理過程中，nHAP粒子的粒徑分布是否能穩定在100 nm范圍內;③nHAP粒子不應該對正常人體細胞產生毒性作用。在考慮nHAP的生物學應用前景時，除了要考慮nHAP粒子本身的性質外，篩選具備生物學惰性的穩定劑、分散劑也是不可忽視的問題。

6 展望

nHAP具有特殊的物理、化學性質及生物特性，表現出良好的骨誘導性及骨結合性，可以作為藥物載體，在生物醫學領域展現出廣泛的應用前景。而且，nHAP具有廣譜抗癌作用，對多種癌細胞的增殖、生長具有抑制作用，但其抗腫瘤機制尚未研究清楚，特別是信號傳導及基因調控等方面。相信隨著研究的不斷深入，對nHAP性能的了解會越來越多，其安全性得以充分的評價，其用途也將越來越廣泛，定會為腦膠質瘤的治療提供新的途徑。

［1］Stupp R，Mason WP，van den Bent MJ，et al．Radiotherapy pllus Concomitant and Adjuvant Temozolomide for Glioblastoma［J］．N Engl J Med，2005，352(10):987-996．

［2］Deorah S，Lynch CF，Sibenaller ZA，et al．Trends in braincancer incidence and survival in the United States:Surveillance，Epidemiology，and End Results Program，1973 to 2001［J］．Neurosurg Focus，2006，20(4):E1．

［3］Sun J，Xue M，Aoki H，et al．Effects of Sr-hydroxyapatite microcrystal on cultured cell［J］．Biomed Mater Eng，1994，4(7):503-512．

［4］Aoki H，Aoki H，Niwa M，et al．An in vivo study on the reaction of hydroxyapatite-sol injected into blood［J］．J Mater Sci Mater Med，2000，11(2):67-72．

［5］李戈，符仁義．羥基磷灰石納米粒子對HL-60細胞增殖抑制作用的研究［J］．腫瘤防治雜志，2005，12(2):103-104．

［6］Li B，Guo B，Fan HS，et al．Preparation of nano-hydroxyapatite particles with different morphology and their response to highly malignant melanoma cells in vitro［J］．Appl Surf Sci，2008，255:357-360．

［7］唐勝利，劉志蘇，錢群，等．羥基磷灰石納米粒子誘導人肝癌BEL-7402細胞凋亡的機制［J］．中華實驗外科雜志，2012，29(4):660-662．

［8］馮衛，付莉，李冬松，等．羥基磷灰石納米顆粒對骨肉瘤MG63抑制作用的體外實驗研究［J］．中國實驗診斷學，2011，15(11):1816-1818．

［9］Itokazu M，Kumazawa S，Wada E，et al．Sustained release of adriamycin from implanted hydroxyapatite blocks for the treatment of experimental osteogenic sarcoma in mice［J］．Cancer Lett，1996，107(1):11-18．

［10］Liang ZW，Guo BF，Li Y，et al．Plasmid-based Stat3 siRNA delivered by hydroxyapatite nanoparticles suppresses mouse prostate tumour growth in vivo［J］．Asian J Androl，2011，13(3):481-486．

［11］馮凌云，閻玉華，夏清華，等．羥基磷灰石溶膠對W-256癌肉瘤細胞內鈣離子濃度及細胞形態結構的影響［J］．中國生物醫學工程學報，1998，17(4):374-377．

［12］Stoka V，Turk B，Schendel SL，et al．Lysosomal protease pathways to apoptosis．Cleavage of Bid，not pro-caspases，is the most likely route［J］．JBiol Chem，2001，276(5):3149-3157．

［13］張建平，夏清華，陳道達，等．羥基磷灰石超微粉對腫瘤細胞系Walker256的 DNA 損傷［J］．實用腫瘤雜志，1997，12(4):245-247．

［14］夏清華，陳道達，林華，等．HASM對W-256細胞系DNA含量及細胞周期的影響［J］．武漢工業大學學報，1999，21(2):5-6．

［15］Donaldson K，Tran CL．Inflammation caused by particles and fibers［J］．Inhal Toxicol，2002，14(1):5-27．

［16］齊志濤，曹獻英，李世普，等．納米磷灰石對人肝癌細胞端粒酶基因表達的影響［J］．武漢理工大學學報，2004，26(7):46-48．

［17］沈維高，王躍華，繆春明，等．羥基磷灰石納米粒子運載Stat3 shRNA對鼠膠質瘤C6細胞的促凋亡效應［J］．北華大學學報(自然科學版)，2012，13(1):53-57．

［18］田昂，王超，薛向欣．Nano-HA涂層與HA/CTS復合涂層抑制膠質母細胞瘤細胞活力作用的比較［J］．功能材料，2010，41(2):300-303．

［19］Tian A，Wang C，Xue XX，et al．Inhibitory effect of nano-HA particles on human U87 glioblastoma cells viability［J］．J Inorg Mater，2010，25(1):101-106．