蛋白質的氨甲?；鳛槁阅I衰時的生物標志物

王繼貴

(中南大學湘雅二醫院，湖南長沙410011)

蛋白質的氨甲?；鳛槁阅I衰時的生物標志物

王繼貴

(中南大學湘雅二醫院，湖南長沙410011)

許多研究已證實氨基甲?；牡鞍踪|涉及各種疾病的進展，特別是慢性腎衰。本文的目的是介紹非酶促蛋白質翻譯后修飾的概況以及其在體內的影響，并評價其作為生物標志物的臨床用途。

氨甲?；?；生物標志物；慢性腎衰

氨甲?；堑鞍踪|翻譯后的一種修飾，來自于異氰酸(isocyanic acid)共價結合到蛋白質上，涉及在蛋白質分子成熟(ageing)過程中非酶促反應之一(即糖化、氧化或氨甲?；?。這些翻譯后修飾的特征是在蛋白質上形成共價結合的加合物，該加合物被稱作翻譯后修飾衍生的產物(posttranslationalmodification-derived products,PTMDPs),它可使蛋白質的結構和功能特性發生改變[1]。

因為由氨甲?；瘉淼漠a物(carbamylation-derived products,CDPs)是有生物活性的化合物，它能觸發特殊的及不適當的細胞反應，例如氨甲?；纱龠M激素和酶失活、蛋白質功能發生改變。CDPs在體內的積聚，能誘導疾病的發生和進展。監測CDPs對特定疾病是一種可能的生化標志物[2]，對慢性疾病復雜性的診斷和治療給予新的洞察力。本文擬對氨甲?；芯康倪M展作一簡要介紹。

1 氨甲酰化反應的生物化學

氨甲?；傅氖羌釉诘鞍踪|或氨基酸的功能基上的“氨基甲?！辈糠?-CONH2)，這個反應主要來自于異氰酸和蛋白質之間的相互作用。在體外，異氰酸鹽同氨基、硫醇和苯酚基或羧基相互作用，硫醇和苯酚基顯示有最高的反應性，但是，它是可逆的，因此，限制了它對蛋白質特性的影響。相反，氨基酸或蛋白質的氨基不可逆地結合到異氰酸上，而且α-氨基比賴氨酸側鏈ε-氨基反應快約100倍，因為它們的pKa較低。

在人類，異氰酸主要由血液中的尿素自發地分解形成氰酸鹽(-N＝C＝O)和含氨物質，它在水溶液中發生，根據平衡反應，它促成99%以上的尿素分解，形成的氰酸鹽迅速轉變成它的反應型異氰酸(HN=C=O)[3]。因此，在慢性腎衰時(Chronic renal failure,CRF)其特征是長期高尿素血癥，它促進異氰酸的形成。在健康個體中，血漿異氰酸的濃度大約為50nmol/L，而在CRF的病人中它達到150nmol/ L。在體內，異氰酸和蛋白質、氨基酸和其他分子之間相互作用，使得這些分子中的氨甲酰化，導致它們的結構、電荷和功能發生改變。影響細胞外和細胞內的各種功能，出現慢性組織損害，是導致疾病發病機理的重要因素。有研究發現在CRF的腎組織中有氨甲?；牡鞍踪|，但是在正常移植腎中則沒有[3]。

然而，尿素分解不是導致異氰酸形成的唯一途徑，特別是在非CRF的病人中。氰酸鹽也可來自硫氰酸鹽的代謝，在抽煙的人中，血中硫氰酸鹽濃度升高。在過氧化氫存在時，髓過氧化物酶催化H2O2氧化硫氰酸鹽(-N=C=S)生成氰酸鹽(-N=C=O)和次硫氰酸(HO-N=C=S)，氰酸鹽迅速地轉變成異氰酸，后者在炎癥中促進蛋白質的氨甲?；痆4]。

理論上講，體內所有蛋白質都可以氨甲?；Ｈ欢?，每種蛋白質氨甲?；目赡苄裕Q于多種參數，如數量和氨基的可接近性，以及蛋白質的壽命。不同的氨基參與反應，則形成不同的氨甲酰化產物，當α-氨基參與反應時，則形成α-甲氨酰氨基酸(或α-甲氨酰蛋白質)；當蛋白質的賴氨酸ε-氨基參與反應時，則形成ε-甲氨酰賴氨酸(也叫高瓜氨酸，homocitrulline)。血漿結合的高瓜氨酸水平，可獨立地預測冠心病、將來發生心肌梗死、腦卒中和死亡的危險因素增加[4]。

2 病理生理學中涉及蛋白質氨甲酰化的基本原理

在人類，首次證實蛋白質氨甲?；挠泻π窃?0年代初得出的。當時用尿素治療鐮狀細胞貧血病人，因為它能阻滯、甚至逆轉鐮狀形成。已提示有兩個機制解釋它的有益作用：(1)尿素分子本身直接干擾鐮狀化形成；(2)由尿素衍生的異氰酸致HbS的氨甲?；?，它增加氧的親和性以及降低聚集特性。后來用氰酸鈉(Sodium cyanate)作為一種口服治療劑，然而，已觀察到意外的副作用，某些病人在口服氰酸鈉的過程中發生了白內障。這個現象可以用α-晶體蛋白氨甲?；瘉斫忉?，它誘導構象改變，使晶體蛋白渾濁。長壽蛋白質特別傾向于翻譯后修飾，氨甲酰化促進晶狀體老化和白內障[5]。

氨甲?；淖兊鞍踪|的結構特性，突出的影響是除去了正電荷，它使蛋白質與水的相互作用改變，且擾亂了離子對蛋白質表面的相互作用，因為這些相互作用被認為可穩定蛋白質的二級和三級結構，它們的喪失導致顯著地構象改變。氨甲酰化也干擾蛋白質-蛋白質間的相互作用。例如，I型膠原蛋白的氨甲?；T導它的三級螺旋結構構象改變，降低聚合成正常膠原纖維的能力，這些改變同氨甲酰化膠原無力刺激中性分葉核粒細胞的氧化功能有關[6]。膠原的氨甲酰化可以改變體內膠原和炎性細胞之間的相互作用和干擾細胞外基質正常結構的改變。

Ha等[7]研究了氨甲?；椎鞍?cAlb)對微小RNA(miRNAs)表達的影響，發現miR-146a/b的表達受cAlb顯著地誘導，miR-146a增加12.75倍，miR146b增加5.88倍。由于cAlb刺激，miR-146 a/ b水平增加，P＜0.05。也發現在腎細胞癌腫瘤組織中，miR-146a/b表達水平增加，與相應的非腫瘤組織比較，P＜0.05。對于cAlb的功能進一步研究，可以提供對腎細胞癌病理生理學新的洞察力。

3 疾病時蛋白質的氨甲?；?/h2>

在體內，因為異氰酸形成的途徑，氨甲?；瘍炏壬婕霸?個病理生理過程：CRF和動脈粥樣硬化[8,9]。在CRF時，慢性尿毒癥刺激LDL氨甲?；?cLDL)，cLDL是一種潛在的導致動脈粥樣硬化因子。本文主要闡述在CRF時涉及的病理生理過程。

在CRF時，氨甲酰化是尿毒癥的一個后果，也是此病的一個惡化因素。例如氨甲?；陌椎鞍资窃鲞M腎小管損害的一個原因，及促進小管周圍纖維化[10]。而且，氨甲?；难獫{蛋白質刺激腎小球增殖以及膠原蛋白合成，因此，有助于腎纖維化。纖維化也能來自于無活性的酶，它涉及結構改變的細胞外基質，及來自不穩定的結構改變的膠原蛋白。的確，氨甲?；T導膠原蛋白三維螺旋構象的不穩定性，是造成蛋白水解敏感度改變的原因，因為氨甲酰化的膠原蛋白顯示對膠原蛋白酶有更大的抵抗性，但是對明膠酶的敏感度增加[11]。而且，氨甲酰化蛋白質可調節炎性細胞的功能，如氨甲?；椎鞍讓χ行远嘈魏肆＜毎暮粑l(respiratory burst)作用的抵制效應可以說明[12]。呼吸爆發是指在再灌注期間，組織重新獲得氧供應，激活中性粒細胞耗氧顯著增加，產生大量氧自由基。中性多形核中性粒細胞氧化功能的這種失調可以促進在尿毒癥病人中所觀察到的炎性及感染性疾病。尿毒癥促成游離氨基酸轉變成氨甲酰化氨基酸，后者已被證實為尿毒癥的毒素，因為它們干擾蛋白質的合成及轉氨作用，且促成胰島素抵抗。

4 可利用的生物標志物及它們與臨床的關聯

4.1 氨甲?；难t蛋白(cHb)cHb主要來自異氰酸共價結合到珠蛋白β-鏈的N末端纈氨酸殘基上，可達總Hb的2%。最初認識cHb是在用離子交換層析法測定HbAlc時的一種分析干擾物。cHb也構成HbAlc形成時的“病理生理干擾”，因為異氰酸同葡萄糖競爭結合N-末端纈氨酸殘基，尿毒癥病人測得的HbAlc值應小心解釋[13]。cHb通常用HPLC紫外檢測器檢測在酸水解得到的N-甲酰纈氨酸的乙內酰脲衍生物。cHb濃度的表達以每克的總Hb中所含纈氨酸乙內酰脲(Valine hydantoin, VH)的微克數表示(μg VH/gHb)，在健康個體參考范圍為27～38μg VH/gHb；在CRF病人中此值約高5倍。cHb增加同Hb暴露于高濃度尿素的時間和程度兩者相關，提示cHb在鑒別急性或慢性腎衰病人時是一個有用的生物標志物。Tarif等[14]研究了CRF病人透析期間cHb水平的變化，結果顯示CRF病人cHb水平增加，且同血液尿素濃度呈正相關，可以更好地反映透析期間尿素濃度的改變，可以用作尿毒癥控制的一個更準確的指征。臨床上，良好透析的病人cHb水平應低于100μgVH/ gHb。

4.2 cLDL它是人血清中的一種非酶促修飾的LDL，通過尿素自發分解產生的氰酸鹽誘導LDL氨甲酰化而形成的cLDL，在CRF的病人則顯著增加，可引起心血管并發癥。目前已發展了ELISA法測定血清cLDL濃度[15]。40例健康對照其濃度為86.1±29.7mg/L，41例終末期腎病血清cLDL濃度則顯著增加，為281.5±46.9mg/L，P＜0.001。此試驗簡單，容易操作，在腎病及健康個體中對心血管疾病的研究，是一個潛在的有價值的工具。

4.3 蛋白質結合的高瓜氨酸前已述及當蛋白質的賴氨酸ε-氨基參與反應時，則形成ε-甲氨酰賴氨酸，也稱之為高瓜氨酸[4]。Mydel等[16]報告蛋白質的翻譯后修飾有可能產生抗原的新表位(neoepitopes)，其后它可能觸發免疫反應。賴氨酸殘基的氨甲?；纬筛吖习彼?，可能是觸發炎性反應的一個關鍵機制。在用鼠模型評價觸發免疫反應中氨甲?；淖饔?，發現含有高瓜氨酸肽的鼠，免疫誘導趨化性、T細胞激活及抗體的產生，鼠也產生侵蝕性關節炎。T細胞反應來自高瓜氨酸肽，以及隨后產生的抗高瓜氨酸自身抗體，是誘導自身免疫反應的關鍵?？垢吖习彼犭目贵w對關節炎的發病機理提供一個新的機制。

5 小結

上述討論涉及蛋白質氨甲?；磻纳锘瘜W及與臨床的關聯。因為氨甲?；a物的測定目前尚需高精設備，有些方法尚未標準化，因此多在研究實驗室使用。然而，大量的證據表明蛋白質和氨基酸的氨甲?；婕霸诙喾N疾病的發病機理及進展中，對于洞察疾病的發病機理可以提供新的信息。隨著科學技術的不斷進步，可利用的分析方法不久就會逐步進入臨床應用。

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1674-1129(2013)05-0409-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.05.001

王繼貴，男，1937年生，湘雅二醫院檢驗科原主任，主任檢驗師，研究方向為臨床生物化學。