枯草桿菌溶菌素9在低密度脂蛋白代謝中作用的研究進展

張明明（綜述），宋光耀（審校）

（河北省人民醫院檢驗科，河北石家莊050051）

枯草桿菌溶菌素9在低密度脂蛋白代謝中作用的研究進展

張明明（綜述），宋光耀*（審校）

（河北省人民醫院檢驗科，河北石家莊050051）

桔草桿菌蛋白酶9；脂蛋白類，LDL；綜述文獻

近年來研究顯示枯草桿菌溶菌9（proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9）是導致常染色體顯性高膽固醇血癥的重要基因［1］，它是迄今為止已經確定的枯草桿菌前蛋白轉化酶超家族的第9個成員，也被稱作神經凋亡調節轉化酶1（neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC-1），PCSK9分布于肝臟、小腸、小腦、腎臟，在肝臟中表達量最高，該基因對胚胎時神經元分化及肝臟再生起重要的作用，可通過降解肝臟細胞上的低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDL-R）來調控血漿中LDL的水平，增強PCSK9活性的突變可以導致高膽固醇血癥和早發冠心病；降低PCSK9活性的突變則導致相反的效應，即降低LDL水平從而減少冠心病的發病幾率。雖然PCSK9的作用機制尚未明確，但PCSK9突變可能為降低血漿LDL水平、防治動脈粥樣硬化和早發冠心病提供新的治療靶點。

1 PCSK9的結構特點

PCSK9編碼的蛋白質稱為NARC-1，一種新的前蛋白轉換酶，屬于枯草蛋白酶亞家族，該基因位于染色體1P32.3，共有12個外顯子，編碼含692個氨基酸殘基的蛋白質，其氨基酸序列可分為信號序列、前片段、催化域、P-域和富含半胱氨酸的碳末端幾個結構域。152位是自身催化裂解的斷裂部，催化區域包含具有催化能力的三聯體Asp186-His226-Ser386以及氧化區域Asn317。PCSK9缺乏蛋白轉化酶家族調節鈣依賴且調節pH值的P結構域（P-domain）［2］，催化域后是一段含有279個氨基酸的富含半胱氨酸的碳末端。蛋白初合成時是一段72kDa的前體，為可溶性的酶原狀態，在內質網經過自身催化后在前片段和催化域之間發生斷裂，PCSK9分子的斷裂位點（Val-Phe-Ala-Gln↓Ser-Ile-Pro），與其他的前蛋白轉化酶不一樣。PCSK9的自身催化斷裂不需要鈣離子［3］。成熟的PCSK9和相關的前片段在分泌前都要經過酪氨酸的硫酸酯化，但PCSK9翻譯后修飾的作用尚未明確［4］。

2 PCSK9表達對LDL-R水平的調節

PCSK9基因突變導致高膽固醇血癥這一發現證實基因突變后或是通過增加PCSK9的正常活性，或是通過賦予蛋白某種新的功能。有研究顯示在野生型C57BL/6小鼠體內導入腺病毒介導的人PCSK9基因使其過表達，與僅導入腺病毒空載體的小鼠相比，血漿總膽固醇明顯提高，非高密度脂蛋白膽固醇C提高5倍，其表型接近于LDL-R基因敲除小鼠；而將PCSK9基因導入膽固醇水平原本較高的LDL-R基因缺陷小鼠，與對照組相比，血脂水平并未進一步增高，提示PCSK9基因增高血漿LDL水平的過程依賴于LDL-R的存在［5］。體外實驗證實，將人PCSK9基因導入培養的細胞，并未見LDL-R mRNA水平改變，但LDL-R蛋白表達卻顯著減少，且細胞對熒光標記的LDL內吞功能顯著降低。PCSK9基因降低細胞表面LDL-R蛋白并干擾LDL-R介導的細胞對膽固醇的攝取，但也有人［6］認為PCSK9基因可能不是通過傳統的固醇調節元件介導的轉錄途徑調節LDL-R表達，而是通過新的機制調節LDL-R功能。在McA RH7777大鼠肝癌細胞中過表達野生型PCSK9，使LDL-R蛋白減少72％，與1，1′-雙十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽（1，1′-dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，DiI）標記的LDL的結合降低52％，而在人肝癌細胞株HuH7中瞬時轉染雙鏈siRNA使LDL-R的表達、DiI和LDL的結合分別增加33％和2.2倍［7］。這提示PCSK9可能通過對LDL-R的負向調節而發揮作用。

與野生型小鼠相比，PCSK9-/-小鼠的血漿膽固醇水平降低48％，肝LDL-R蛋白的水平升高2.8倍，而LDL-R mRNA則沒有明顯變化，這與PCSK9過表達降低LDL-R蛋白水平而不改變LDL-R mRNA相一致［8］。因此，可以推斷無論是野生型還是突變體，PCSK9的過表達通過翻譯后機制來降低LDL-R的水平。

3 細胞內PCSK9的作用位點

在細胞內PCSK9和LDL-R的作用路徑一致，在細胞表面則有所不同，LDL-R與細胞膜結合而PCSK9則迅速分泌到細胞質中去。PCSK9還可以通過肝臟分泌到細胞外，因此可以在血漿中檢測到［9－10］。PCSK9在細胞內的作用位點尚未明確。在HepG2細胞中，PCSK9的過表達并不能影響LDL-R合成或從內質網向外轉運，而且蛋白體抑制因子也不干擾PCSK9介導的LDL-R水平的下調。PCSK9的高表達增加了成熟的、糖基化形式的LDL-R的降解。但布雷菲德菌素a（一種可以引起高爾基復合體分解的真菌毒素）可以阻止PCSK9對LDL-R的降解。這些資料顯示在LDL-R從內質網向細胞膜表面轉運的過程中，PCSK9可促進其降解［11］。

另一方面，PCSK9在分泌通道中并無活性，而只在分泌后作用于LDL-R。在分泌過程中，前片段與成熟蛋白緊密結合，據推測其作用是抑制PCSK9的催化活性。在其他的前蛋白轉化酶中，前片段在高爾基體或分泌后經過第2次蛋白酶解加工解除其抑制作用，暴露酶活性。初步的實驗證據顯示PCSK9還可以在細胞外發揮其作用，把純化的PCSK9或含PCSK9的條件培養基作用于HepG2細胞，可以減少HepG2細胞表面LDL-R的數目。當外源性PCSK9作用于細胞時，LDL-R與PCSK9迅速發生免疫沉淀反應，這一現象暗示兩種蛋白之間存在某種物理聯系，在常染色體隱性高膽固醇血癥（autosomal recessive hypercholesterolemia，ARH）患者中，缺乏一種LDL-R細胞內攝作用所必需的內吞銜接蛋白，而這種蛋白對PCSK9介導的LDL-R的降解是必要的，ARH患者缺少這種蛋白，LDL-R和PCSK9都不能被細胞攝入，不能發揮相互作用，因此LDL-R的數目沒有改變［12］。以上研究結果揭示了PCSK9加速LDL-R降解的幾種作用機制，在細胞表面，PCSK9以無催化活性的形式與LDL-R結合，然后進入細胞內，在酸性環境下發揮其作用，導致LDL-R降解。另一方面，與LDL-R結合，PCSK9可能妨礙細胞內攝作用后LDL-R的正常再利用，使LDL-R在溶酶體降解而不是回到細胞表面。

4 PCSK9功能獲得型突變

與高膽固醇血癥有關的PCSK9突變稱為功能獲得型突變。PCSK9選擇性錯義突變可以導致高膽固醇血癥。血漿中主要攜帶膽固醇的脂蛋白，LDL-C的水平取決于LDL生成與清除的相對比率。

Lambert等［13］在2個法國家庭中發現了位于1號染色體短臂三區二帶與ADH相關的錯義突變，這兩個錯義突變是PCSK9外顯子2的S127R（625T＞A）突變和外顯子4的F216L（890C＞T）突變。

自此開始，陸續有人報道PCSK9的錯義突變，這些突變均導致高膽固醇血癥，而且報道中沒有發現LDL-R和ApoB基因突變。包括L108R突變［1］、D35Y突變［1］、D374Y突變［14－15］，R218S、R357H突變［16］、c.1863＋94A＞G突變［17］、I474V突變［18］、外顯子6的R306S突變［19］、A617D突變［20］以及E670G突變［21］等。另外，在FH患者中還發現了3種PCSK9錯義突變R469W、N425S、R496W。其中，外顯子12的E670G突變［21］可引起血漿LDL-C水平的升高，有3.5％變異率，是LDL-C水平和冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度的基因標志物。

5 PCSK9功能缺失型突變

PCSK9引起低膽固醇血癥的突變又稱為功能缺失型突變。無義突變和錯義突變均可引起低膽固醇血癥。Cohen等［22］對DHS中1769例LDL-C水平低于正常人群5個百分點的非裔美國人PCSK9的編碼區域進行測序，發現每50例非洲裔美國人中就有1例發生了無義突變Y142X或C679X，使LDL的水平下降40％。在DHS中1784例非非裔的美國人中，1例西班牙人和1例歐洲人的PCSK9基因中均發現了C679X突變，該突變導致了終止密碼子提前出現。但在攜帶該突變的雜合患者中發現膽固醇的內源性生物合成或腸道吸收似乎都沒有發生改變。在DHS研究的非裔美國人中，Y142X和C679X突變率為1.8％；而在伊利諾斯州庫克郡的850例非裔美國人中，上述兩個突變的發生率為2.2％。在來自優魯巴語鄉村社區的549例尼日利亞人中C679X突變率為1.4％。在津巴布韋653例產婦中發現3.7％的患者存在C679X突變，而且血漿LDL-C水平明顯低于無突變人群［23－24］。此外，Zhao等［25］還發現YI42X突變影響mRNA的生物合成過程，故不能生成成熟的PCSK9蛋白。C679X突變不改變自身催化活性，但C-末端的半胱氨酸提前終止干擾蛋白的正確折疊，導致成熟蛋白滯留于內質網。這些結果提示YI42X突變影響蛋白的合成，C679X突變干擾蛋白的折疊。

其他與血漿LDL-C水平下降有關的PCSK9突變陸續被發現，包括框內突變和錯義突變，如L235F突變、A443T突變、R46L突變、Q152H突變、P174S突變、G106R突變、R237W突變［24，26－29］。其中非裔美國人中發現的L235F突變可使LDL水平下降30％，A443T突變的純合子和雜合子使LDL-C分別下降29.2％和3.5％。R46L突變在歐洲人中的發生率為3.4％，LDL水平下降了21.3％。而Cameron等［28］認為G106R雖不影響Asp186-His226-Ser386的催化能力，但可顯著降低自身催化能力，導致成熟蛋白顯著減少。

6 問題與展望

PCSK9錯義突變引起人類常染色體高膽固醇血癥的原因即“功能獲取機制”。這些致病突變基因的發現有助于深入探討膽固醇代謝的調節機制，能進一步將LDL-C從血管中清除，阻止造成冠心病的血管斑塊形成。盡管關于PCSK9基因在LDL代謝中的生物重要性的研究已經取得了很大的進展，但還有許多重要的機制和臨床問題有待解決。首先，PCSK9表達和功能獲得型突變促進LDL-R降解的作用機制還有待于進一步闡明；第二，盡管已經提出了PCSK9的結構模型，但晶體模型尚無報道。對PCSK9的3D結構的闡述為PCSK9的作用機制的研究提供了一個新的角度。還需要進一步證實PCSK9在細胞中的作用位點，以及LDL-R的降解是否與其催化活性相關。盡管PCSK9的遺傳缺陷與獨立于LDL代謝的明顯表型不相關，PCSK9仍可能通過其他途徑發揮作用。因此，對PCSK9研究尚不完善，需繼續深入研究。

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（本文編輯：劉斯靜）

R543.1

A

1007-3205（2013）04-0490-05

2012－08－14；

2012－09－04

張明明（1976－），女，河北秦皇島人，河北省人民醫院主管檢驗師，醫學博士，從事內分泌代謝疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：Sguangyao＠sohu.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.04.047