內(nèi)毒素識別、內(nèi)化及清除相關受體的研究進展＊

余夢辰 綜述，李 斌，周 紅 審校

（第三軍醫(yī)大學藥學院藥理學教研室，重慶 400038）

內(nèi)毒素（lipopolysaccharide／endotoxin，LPS）是革蘭陰性菌胞壁外膜主要成分，由3部分組成：O－特異性側(cè)鏈、核心多糖和脂質(zhì)A（Lipid A）。LPS進入機體后，免疫細胞可通過相關模式識別分子識別LPS，誘發(fā)失控性炎癥反應。其中，單核／吞噬細胞系統(tǒng)是LPS的主要效應細胞，其胞膜表面的模式識別受體是識別啟動炎癥反應的始動因素。肝臟是人體最大的清除外來有毒物質(zhì)的器官，肝枯否細胞是全身最大的組織巨噬細胞群，是清除降解LPS的重要免疫細胞，肝竇狀內(nèi)皮細胞也可充當清道夫角色，可不依賴枯否細胞獨立清除LPS［1］。本文就近年來有關單核／吞噬細胞系統(tǒng)內(nèi)化清除LPS相關受體的研究進展予以綜述。

1 mCD14

mCD14主要以GPI錨狀物附在單核／巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞表面，無跨膜結(jié)構和胞漿段，需通過與Toll樣受體4（TLR4）相互作用參與LPS的信號轉(zhuǎn)導。LPS進入體循環(huán)后以聚合物形式存在，血漿中的脂多糖結(jié)合蛋白使LPS聚合物轉(zhuǎn)換為單體，形成LPS－LBP復合物與mCD14結(jié)合，再將LPS轉(zhuǎn)移到TLR4／MD－2復合物，激活下游信號轉(zhuǎn)導。LPS能刺激細胞表面LBP／mCD14表達上調(diào)，提高細胞對LPS敏感性，LPS的許多生物學效應即通過此增敏效應實現(xiàn)。

2 Toll受體家族

Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）家族是天然免疫系統(tǒng)中最重要的一類模式識別受體（PRR），結(jié)構高度保守，能識別細菌、真菌、病毒和瘧原蟲等。TLRs為Ⅰ型跨膜蛋白，胞外區(qū)為富含亮氨酸的重復序列，胞內(nèi)區(qū)具有與Toll和白細胞介素1（IL－1）受體家族同源的結(jié)構域 TIR［2］。目前已發(fā)現(xiàn)的TLRs有13種，分別識別不同的病原相關分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP），如 TLR2可識別革蘭陽性菌的細菌脂蛋白，TLR4則是LPS的識別受體。

2.1 TLR4 TLR4廣泛表達在單核／巨噬細胞、中性粒細胞及上皮細胞中。LPS侵入機體后，可通過作用于TLR4下游的MyD88依賴和非MyD88依賴性信號轉(zhuǎn)導途徑激活胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，啟動炎癥反應。

（1）MyD88依賴性信號轉(zhuǎn)導途徑：在LBP和mCD14參與下LPS被轉(zhuǎn)運至TLR4／MD－2復合物，MyD88招募IL－1受體相關激酶（IL－1receptor－associated kinase，IRAK），使IRAK 磷酸化而激活，而后IRAK－1從復合體上解離，結(jié)合于腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor－associated factor 6，TRAF6）并使其活化［3］。TRAF6通過兩條途徑進行信號轉(zhuǎn)導，一是通過泛素化活化轉(zhuǎn)化生長因子激酶1（transforming growth factor－B－activated kinase－1，TAK1），降 解 I－κB，活 化NF－κB誘導炎癥相關基因表達；二是通過（mitogen－activated protein kinases，MAPK）途徑，激活p38、JNK、ERK1／2等介導炎性因子表達［4］。

MyD88非依賴性信號轉(zhuǎn)導途徑：TLR4胞內(nèi)段與TRAM（TRIF－related adaptor molecule）作用，進而與 TRIF（Toll／IL－1Rdomain－containing adaptor inducing IFN－β）結(jié)合，磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor－3，IRF－3），誘導目的基因的轉(zhuǎn)錄。TRIF還可通過TRAF6激活NF－κB，誘導炎癥相關基因表達［5］。

TLR4也可介導LPS的內(nèi)化，TLR4識別游離的LPS后細胞質(zhì)側(cè)面的網(wǎng)格蛋白牽拉質(zhì)膜向內(nèi)凹陷，形成有被小泡。內(nèi)化的有被小泡形成內(nèi)體并和溶酶體融合，囊泡酸化后經(jīng)多種蛋白酶作用降解清除。阻礙LPS受體識別或封閉網(wǎng)格蛋白的表達均會導致LPS內(nèi)化程度降低。研究表明LPS內(nèi)化不僅與其降解、代謝有關，也與細胞的活化有關，如內(nèi)體酸化抑制劑氯喹可通過影響早期體內(nèi)的成熟抑制LPS誘導的細胞活化［6］，在LPS的內(nèi)化障礙模型中，LPS誘導的炎癥因子的釋放水平降低，且NF－κB的活化受到顯著抑制［7］。此外，許多負調(diào)控分子如IRAK－M，A20等也可對TLR4介導的信號轉(zhuǎn)導通路起抑制作用。TLR4還與其他LPS識別受體相互協(xié)同、相互制約，共同參與維持機體平衡。

2.2 TLR2 TLR2是革蘭陽性菌的主要識別受體，也能識別LPS并介導細胞LPS反應。但TLR2與LPS的親和力較低，當TLR4存在時細胞對LPS的識別無須TLR2的參與。TLR2與TLR4也存在協(xié)同作用和交叉耐受作用，且在LPS誘導的醛固酮分泌過程中，TLR2與TLR4都參與了信號轉(zhuǎn)導間的溝通［8］。LPS刺激可導致TLR2mRNA在腦、肝、肺、腎的表達上調(diào)，但在脾臟中的表達下調(diào)。另有研究顯示，在LPS刺激下TLR2的蛋白水平表現(xiàn)為上調(diào)，然而在LPS與腺苷同時存在的情況下，TLR2的蛋白水平則呈下調(diào)。

3 清道夫受體

清道夫受體（scavenger receptor，SR）是巨噬細胞膜上帶有膠原結(jié)構的三聚體膜蛋白，具有結(jié)合被修飾低密度脂蛋白等帶負電荷配體的活性。可分為8個家族，即SR A～H。近來的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞表面的SRs具有結(jié)合和清除細菌及LPS的作用。其中SR－A、SR－B是單核／吞噬細胞系統(tǒng)參與天然免疫的主要SR。

3.1 SR－A A型SR表達于大多數(shù)組織的巨噬細胞、骨髓來源樹突狀細胞、脾樹突狀細胞，是1種調(diào)控吞噬、降解LPS的防御性受體。SR－A可與LPS的Lipid A結(jié)合，通過受體介導的網(wǎng)格蛋白依賴途徑介導對LPS的內(nèi)化后迅速移至溶酶體內(nèi)，經(jīng)脫磷酸和脫酰基作用被代謝、降解。與其他LPS受體不同的是，SR－A介導的LPS內(nèi)化清除不會激活巨噬細胞、誘導炎癥介質(zhì)的釋放。SR－A表達的上調(diào)可促進RAW264.7細胞結(jié)合、內(nèi)化LPS，并抑制炎癥因子釋放和NF－κB活化。SR－A的激活還與TLR4誘導的信號轉(zhuǎn)導可相互影響。一方面LPS刺激巨噬細胞后激活的SR－A可抑制TLR4誘導的細胞活化，從而降低炎癥因子的釋放［9］；另一方面，LPS通過激活的TLR4下游信號轉(zhuǎn)導使巨噬細胞SR－A表達上調(diào)［10］。但也有文獻報道，LPS刺激對SR－A表達的上調(diào)與TLR4信號轉(zhuǎn)導通路無關，而是由p38信號通路調(diào)控［11］。

SR－A還可通過識別革蘭陰性菌胞壁上的LPS而直接與革蘭陰性菌結(jié)合，是多種革蘭陰性菌內(nèi)化入胞的識別受體。SR－A基因敲除小鼠更易受到細菌感染，且對革蘭陰性菌的吞噬能力會減弱［12］。

3.2 MARCO MARCO僅表達于脾邊緣區(qū)的巨噬細胞、腹腔巨噬細胞等部分巨噬細胞，因其結(jié)構與SR－AⅠ高度相似而被劃分為SR－A，但功能和分布與SR－A有明顯差異。MARCO缺少SR－AⅠ的繞線式α螺旋結(jié)構域，但有較長的膠原結(jié)構域，具有結(jié)合細菌和被修飾LDL的作用，可通過其C末端的SRCR結(jié)構域與細菌結(jié)合，參與巨噬細胞對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的吞噬過程［13］。通常認為LPS是 MARCO參與天然免疫反應的主要配體，有研究顯示，MARCO的表達可受Toll受體激活的MyD88y依賴和非MyD88依賴信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)控。但MARCO和SR－A在LPS誘導巨噬細胞的炎性因子釋放進程中的行為不同，SR－A可抑制LPS刺激巨噬細胞誘導的IL－12的釋放，但MARCO則可刺激IL－12的釋放。

3.3 SR－B B型SR是清道夫受體超基因家族成員，分為SRBⅠ、SR－BⅡ和CD36，參與機體脂類代謝、動脈粥樣硬化形成與保護、細胞粘附和凋亡細胞的清除等生命過程。SR－BⅠ和CD36與LPS內(nèi)化清除有關，有關SR－BⅡ生理意義的研究尚少見。

SR－BⅠ主要在肝臟、腎上腺及脂肪組織中表達，與高密度脂蛋白有高度的親和性，是抗動脈粥樣硬化的關鍵因子之一。體外實驗表明，SR－BⅠ可與LPS直接結(jié)合，并促進LPS的攝取與清除［14］。SR－BⅠ缺陷型小鼠對LPS誘導的LPS休克可表現(xiàn)出了更強的免疫炎癥反應。SR－BⅠ也參與了肝細胞對血漿中LPS的清除，且這種清除作用在HDL的輔助下效率更高［15］。LPS可通過TLR2、TLR4的PI3K／Akt信號通路影響SR－BⅠ的表達［16］，NF－κB的活化對SR－BⅠ的表達起負調(diào)控作用［17］。SR－BⅠ亦可抑制TLR4誘導的 NF－κB的活化。

CD36是一種與SR－BⅠ高度同源的膜糖蛋白，可在血小板、單核／巨噬細胞、樹突狀細胞等多種細胞中表達。研究表明，CD36可識別革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，并可通過非TLR2／4依賴的JNK信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)LPS誘導的信號轉(zhuǎn)導［18］。

4 膜突蛋白

膜突蛋白（membrane－organizing extension spike protein，moesin）屬ERM（ezrin，radixin，moesin）家族成員之一，表達于單核／巨噬細胞的表面。早期研究認為moesin主要在結(jié)合細胞骨架、維持細胞的形狀、黏附及運動中起重要作用，近年來發(fā)現(xiàn)還參與LPS誘導的炎癥反應。抗moesin抗體能劑量依賴性地抑制LPS刺激巨噬細胞釋放TNF－α，皮下注射LPS在moesin－／－型小鼠體內(nèi)引起的炎癥反應程度比對照組低3倍，說明moesin參與了LPS誘導的炎癥反應［19］。

moesin在CD14／TLR－4信號轉(zhuǎn)導過程中扮演重要角色。LPS可與moesin的C末端結(jié)合，促進moesin的表達和磷酸化。在LPS刺激過程中，moesin始終與CD14直接結(jié)合，并可與TLR－4／MD2復合物結(jié)合。阻斷 moesin后，LPS誘導的MyD88信號通路被阻斷，p38、ERK以及NF－κB的活化均被抑制［20］。

5 酰基羧酸水解酶（acyloxyacyl hydrolase，AOAH）

AOAH并非LPS識別受體，而是一種內(nèi)源性LPS水解酶，與LPS清除和LPS相關受體關系密切，因此將其一同納入綜述。AOAH主要分布于肝KCs、巨噬細胞、樹突狀細胞等，可選擇性水解LPS的脂質(zhì)A酰氧酰基基團上的次級酰基鍵，促使LPS的Lipid A結(jié)構暴露從而被AOAH降解［21］。小鼠腹腔注射LPS后，肝、肺組織中的AOAH mRNA表達及活性均明顯提高。炎癥反應時，AOAH可在胞內(nèi)水解LPS，也可在胞外發(fā)揮去酰基化作用，但AOAH胞外水解LPS的活性較胞內(nèi)緩慢。AOAH還可降解革蘭陰性菌胞膜上的LPS，降解后的LPS（deacylated lipopolysaccharide，dLPS）可通過與LPS競爭性結(jié)合LBP、CD14或抑制IL－8的釋放從而阻礙完整的LPS刺激免疫細胞。研究發(fā)現(xiàn)，LPS的酰基鏈是LPS與MD－2結(jié)合的關鍵部位，因此推斷dLPS由于與TLR4／MD－2結(jié)合受阻而阻斷LPS的刺激作用［22］。

研究顯示，Aoah－／－型小鼠和野生型小鼠同時靜脈注入LPS，Aoah－／－型小鼠較野生型小鼠更容易表現(xiàn)出不可逆的肝、脾腫大。而高表達AOAH基因的小鼠，LPS攻擊后恢復比野生型小鼠快，且可以避免小鼠出現(xiàn)肝、脾腫大［23］。但LPS或革蘭陰性菌攻擊的Aoah－／－型小鼠和Aoah＋／＋型小鼠存活率及炎癥反應并無區(qū)別［24］。經(jīng)LPS預處理的Aoah－／－型小鼠對大腸埃希菌攻擊更為敏感，TNF－α和IL－6的釋放被延遲，且在細菌感染的最初24h，小鼠體內(nèi)的細菌大量繁殖［25］。提示AOAH可能是在LPS感染的晚期通過降低免疫細胞活性、抑制過度的炎癥反應對機體起到保護作用。

6 展 望

LPS的識別與清除是由多器官、多系統(tǒng)協(xié)同參與的復雜的過程。許多種生物大分子參與LPS識別和清除，膿毒癥不同時期或／和不同階段需要不同的生物大分子的參與，發(fā)揮不同的生理作用，促使單核／吞噬細胞系統(tǒng)迅速清除、滅活LPS，并啟動促炎癥和抗炎癥反應，使機體免受損害。對參與LPS降解清除的相關模式識別受體和生物大分子之間相互關系做進一步深入的研究，將有助于明確膿毒癥的發(fā)病機制，為臨床膿毒癥防治提供新的理論依據(jù)。

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