ITRAQ蛋白技術在消化系腫瘤研究中的應用＊

王 鳴 綜述，王志強審校

（中國人民解放軍總醫院南樓消化內鏡診療科，北京100853）

蛋白質組學研究策略能高通量地、動態地對比分析健康和疾病不同狀態下蛋白質表達譜的改變，可有效地應用于腫瘤標志物的篩選、鑒定、腫瘤分類、治療效果的評價及腫瘤發生機制等方面的研究，使得腫瘤的診斷、分類、療效評價由過去應用單一的腫瘤標志物進行判斷發展成為現在的應用蛋白質譜或基因表達譜的改變來進行綜合判斷。

蛋白組學研究技術中雙向凝膠電泳技術是目前使用較為廣泛的、發展最為成熟的蛋白質組學研究方法。雙向凝膠電泳技術及其他蛋白質組學研究技術無法進行多組樣本的同時研究，也無法進行定量蛋白質組學研究，即便是此后出現的同位素標記親和標簽技術也只能對蛋白質進行相對定量研究。2004年美國應用生物系統公司推出了一項新的同位素標記技術：同位素標記相對和絕對定量（isobaric tag for relative and absolute quantitation，ITRAQ），可真正實現對蛋白的絕對定量檢測，其關鍵是iTRAQ試劑。該試劑由三部分組成，一端為指示基團，中間為中性平衡基團，另一端為反應基團，指示基團的相對分子質量有4種，分別為114.1×103、115.1×103、116.1×103和117.1×103，與之相對應的平衡基團相對分子質量依次為31×103、30×103、29×103和28×103，4種指示基團及其相對應的平衡基團的相對分子質量和都為145.1×103，故iTRAQ技術有4個試劑，即114、115、116、117，可以同時研究4組樣品；而反應基團能與氨基酸N端及賴氨酸側鏈連接的胺標記同重元素，亦也可以標記修飾后的氨基酸，故可對磷酸化蛋白、糖基化蛋白等翻譯后修飾蛋白進行定量、定性研究。ITRAQ聯合液相串聯質譜技術（liquid chromatography coupled mass spectrum）可同時檢測4組或者8組的樣品，為多個不同時間段的樣品分析、膜蛋白研究、疾病標志物的發現與鑒定提供定量信息，并可為感興趣的目標蛋白進行絕對定量，且比其他蛋白質組學定量方法更加得敏感［1－3］。iTRAQ技術的大體流程為：樣品先經胰蛋白酶裂解、烷基化、酶解成肽段，隨后用iTRAQ試劑多重標簽進行差異標記，再將標記樣本相混合，最后用LC－MS／MS進行檢測，檢測后得到的數據采用生物信息學進行分析［2］。

本文綜述了iTRAQ技術在消化系腫瘤研究中的應用，主要從標志物篩查、腫瘤發生、發展機制及腫瘤治療研究三方面進行闡述。

1 標志物篩查研究

蛋白質組學技術早先是主要被應用于尋找腫瘤標志物，科學家們期待能夠通過蛋白質組學研究尋找到能夠應用于腫瘤診斷、甚至早期診斷的標志物。iTRAQ技術自應用來，也是如此。

Pawar等［4］采用了iTRAQ結合液相質譜技術比較了食管癌及癌旁組織的蛋白差異，共發現257個蛋白在兩組間存在差異，其中包含一些既往已被證實在食管癌組織中升高的蛋白質，如凝血酶敏感蛋白1、骨膜蛋白1及熱休克蛋白70等，此外還發現并通過免疫組化證實一些新的蛋白在食管癌組織中高表達，如前列腺血清酸性磷酸酶、網格蛋白1、二硫鍵異構酶A4；證實iTRAQ技術用于尋找腫瘤標志物可靠，且能有新的發現。

Loei等［5］通過對胃癌細胞系AGS and MKN7分泌物蛋白組學檢測，并從中篩選出胃癌細胞分泌蛋白，并對蛋白進行免疫組化驗證，發現顆粒體蛋白（GRN）在胃癌組織中顯著升高，且在血清中得到進一步驗證；用血清血清顆粒體蛋白診斷胃癌ROC曲線下面積可達0.64，認為這一指標可以用于胃癌診斷。Chong等［6］比較健康人、早期胃癌、晚期胃癌患者血清蛋白差異，發現血漿C9蛋白在胃癌患者中顯著升高，且在晚期胃癌中升高高于早期胃癌，盲法檢測顯示C9用于診斷胃癌的靈敏度可達90%，特異度可達74%，血漿C9檢測有望能夠改善胃癌的篩查。而Chong等［7］同時也通過胃癌動物模型和細胞系研究，發現α胰蛋白酶抑制劑H3重鏈在胃癌動物模型血清中顯著升高，隨后在胃癌患者及對照血清中的檢測證實，血清α胰蛋白酶抑制劑H3重鏈可用于胃癌診斷，用于診斷胃癌的靈敏度可達96%、特異度可達66%。

在肝癌標志物研究中，許多研究者都用iTRAQ技術通過不同的標本路徑入手，得到了很多新的發現。Chaerkady等［8］從肝癌組織標本入手，找到了一些新的蛋白如干擾素誘導蛋白、蛋白乳表皮生長因子8、骨髓相關分化標志物、纖維介素等在肝癌組織中高表達，而幾乎所有涉及尿素代謝途徑的蛋白都顯著降低，證實定量蛋白質組學技術用于尋找腫瘤標志物是可行的，且有新的發現。Lee等［9］則選擇血清樣本研究，以和肝癌的起源、進展相關N－聯聚糖蛋白為篩尋目標，采用iTRAQ定量蛋白質組學技術檢測肝癌和健康人血漿蛋白，找到了14個差異的N－聯聚糖蛋白，其中玻連蛋白及抗凝血酶Ⅲ在肝癌患者血清中升高，在肝癌組織中也發現同步升高。除肝癌標志物外，Wang等［10］通過對動物肝癌轉移腫瘤模型研究發現轉醛醇酶在肝癌轉移動物模型組織和血清中升高，并在人肝癌患者血清中得以證實，轉醛醇酶用于診斷轉移肝癌和非轉移肝癌其靈敏度為77.8%，特異度為86.1%。

Jankova等［11］用iTRAQ結合質譜比較了結腸癌腫瘤黏膜及癌旁正常黏膜的蛋白差異，其中涉及糖酵解、鈣結合及蛋白酶抑制等方面蛋白在結腸癌組織中升高，而這些蛋白可能成為結腸癌的腫瘤標志物。為了研究更加精確，得到純度更加高的腫瘤標本，通過顯微切割結腸癌組織獲取結腸癌細胞，經iTRAQ檢測鑒定發現嗅球蛋白4在腺瘤及早期結腸癌組織中高表達，Besson等［12］認為嗅球蛋白4可能作為早期的結腸癌標志物。以上研究結果均在組織中得以證實，但未在血清中得以驗證，其結果作為診斷的標志物效果則有待商榷。而Fan等［13］采用iTRAQ技術結合質譜技術檢測結腸癌及癌旁組織，發現SEC61β表達于癌組織中3倍高于癌旁正常組織，研究發現SEC61β用于診斷結腸癌的靈敏度可達79%，特異度可達75%，這一結果將來可能改善結腸癌的臨床診斷。

2 腫瘤機制研究

腫瘤生長受到多種因素的調節，其中就受到腫瘤細胞的分泌蛋白調節。iTRAQ蛋白技術被用于研究胃癌不同分化能力的細胞系分泌蛋白。研究發現并已驗證組織蛋白酶S在胃癌細胞分泌物中高表達。組織蛋白酶S涉及胃癌細胞分化遷移侵襲，大約197種蛋白和組織蛋白酶S途徑相關。組織蛋白酶S與胃癌轉移密切相關，而這一結果將為后續的研究奠定基礎［14］。為研究結腸癌中Smad4調節轉化生長因子β傳導（TGF－β）途徑，Ali等［15］運用iTRAQ 技術比較Smad4陰性和Smad4陽性的結腸癌細胞系蛋白差異，發現TGF－β途徑中S100A4蛋白的表達與Smad4相關。Ghosh等［16］通過比較結腸癌淋巴轉移細胞系和原位細胞系的蛋白差異，發現在結腸癌高轉移細胞系中β－連環蛋白低表達伴隨鈣結合蛋白（一種β－連環蛋白降解蛋白）高表達；提示鈣結合蛋白高表達和腫瘤的高轉移相關，且鈣結合蛋白高表達細胞系細胞黏附功能降低，這一結果的發現將有助于人們更好的理解結腸癌轉移。類似iTRAQ技術應用于消化系腫瘤機制的研究不多，但隨著研究深入，這類研究會給人們越來越多的驚喜。

3 腫瘤治療探索

肝癌多重耐藥性一直是肝癌治療的障礙，其耐藥的原因錯綜復雜。iTRAQ技術比較BEL7402肝癌細胞系5－FU耐藥和非耐藥細胞株的蛋白差異，發現在耐藥細胞株中ANXA3蛋白高度表達，有助于進一步理解肝癌耐藥原因，為肝癌藥物治療提供新思路［17］。

短鏈脂肪酸被證實能夠通過誘導細胞成熟，抑制腫瘤細胞生長，分化及凋亡。Tan等［18］通過比較經丁酸鹽短期干預后的結腸癌細胞及未干預的結腸癌細胞蛋白差異，發現一批與丁酸鹽作用相關蛋白，這些蛋白涉及腫瘤細胞生長、凋亡和轉移方面，明確丁酸鹽治療結腸癌的機制，也提供了結腸癌化療和新藥物治療的新靶點。而Kilner等［19］則通過iTRAQ技術進一步證實短鏈脂肪酸中除丁酸鹽外戊酸鹽、丙酸鹽均有相類似作用，但具體作用方式略有不同。丁酸鹽作用靶點主要在于角蛋白和中間絲，而戊酸鹽位點在β微管蛋白亞型表達和微管，丙酸鹽則涉及中間絲，這些研究結果為治療提供了更加明確的方向。抗腫瘤藥物LY294002抑制結腸癌磷酸肌醇3激酶途徑，但其具體機制一直不明。通過比較結腸癌細胞系經LY294002處理前后蛋白差異，研究者發現結腸癌細胞LY294002處理后氨酰基－tRNA合成酶、分子伴侶及糖酵解酶等顯著減少，而這些酶與P53基因相關，故LY294002抗血管生成作用可能通過P53基因作用，故抑制P53基因突變在結腸癌磷酸肌醇3激酶途徑治療中起重要作用［20］。

iTRAQ技術的出現大大促進了蛋白質組學的發展，但其也存在著一定的缺點性，如：由于iTRAQ試劑幾乎可以與樣本中的所有蛋白結合，易受樣本中雜質蛋白及樣本處理過程中緩沖液污染；因此對待測樣本進行預處理，并盡量減少操作過程中的污染，操作的精細和質量控制尤為重要，另外，iTRAQ試劑昂貴；但無論如何iTRAQ技術大大促進了消化系腫瘤蛋白質組學研究，隨著后續技術的完善和研究投入增加，iTRAQ必將更加廣泛地應用在消化系腫瘤的各個方面，且研究將會更加的精細和完善。

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