絲素組織工程支架的結構相容性與細胞相容性

劉小甜，楊明英，鄧連霞，朱良均

（浙江大學 動物科學學院應用生物資源研究所，浙江 杭州，310058）

1 前言

組織工程技術是一項用于治療組織和器官缺損的新手段，該技術通過運用細胞生物學和工程學的原理與技術，設計、構建、改良和培養生物活體組織，以修復和重建組織器官的結構和功能[1]。組織工程技術的核心是建立由細胞和生物材料構成的三維空間復合體。其中，支架材料是該復合體的主要元素之一，其主要作用包括：①為細胞粘附提供物理支撐，以支持新生組織的生長，并能被生物降解；②為細胞增殖、分化、代謝提供空間；③提供特定的宏觀、微觀結構，引導細胞構建特定功能的組織或器官；④傳遞化學或力學信號，調控細胞的形狀。

絲素是蠶絲的一種天然高分子纖維蛋白，含量約占蠶絲的70%～80%，含有18種氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸約占總組成的80%以上。Altman等[2]認為絲素蛋白具有如下優點：①與其他天然纖維和許多高性能合成纖維相比，有獨特的力學性能；②在外科領域的應用已有很長歷史；③可加工成膜、顆粒、纖維、支架等多種形態，加工工藝相對簡單；④可通過某些氨基酸的氨基和側鏈的化學修飾，較容易地改變表面性能；⑤在體內外可以緩慢降解；⑥對生物體無危險性，對其免疫系統的副反應較小。因此，絲素蛋白已被廣泛應用于組織工程的研究。

2 絲素蛋白支架的生物相容性

組織工程支架材料的生物相容性，包括生物降解性、結構相容性和細胞相容性等多方面的要求。支架材料的生物降解性，包括生物可降解程度、降解速率影響因素、降解機理等。結構相容性是指，為了滿足生理負荷的需要，支架應提供暫時性的物理支持以承受外部和內部的應力直至新生組織形成，因而必須與新生組織以及機體的植入部位達到一定的力學匹配。細胞相容性包括細胞在材料上的黏附，遷移，增殖，分化，凋亡等情況。本文重點介紹絲素支架材料的結構相容性和細胞相容性的研究情況。

2.1 絲素支架材料的結構相容性

劉洋等[4]以犬牙周膜細胞為種子細胞，以殼聚糖—絲素蛋白—磷酸三鈣復合物作為支架材料，研究該材料用于牙周組織工程的特征。研究表明，以犬牙周膜細胞為種子細胞，殼聚糖—絲素蛋白—磷酸三鈣復合物支架材料與單純殼聚糖支架材料相比，有更適宜的多孔結構及較理想的骨誘導作用，具有更強的結構相容性和再生能力，可作為牙周組織再生的理想支架材料。

鞠剛等[5]用軟骨誘導脂肪干細胞接種于絲素蛋白/羥基磷灰石支架材料上，發現復合材料無論是在機械強度上還是誘導分化上均比單一材料更符合軟骨組織的生理結構和特點，新生的組織在大體和組織形態上類似正常軟骨組織，能夠形成透明軟骨，修復動物膝關節全層軟骨缺損，重建關節的解剖結構和功能。脂肪干細胞和SF/HA復合支架體內誘導產生的軟骨樣組織和軟骨下骨組織與周圍正常組織融合良好，為今后組織工程修復軟骨中復合材料的應用進行了新的嘗試并提供了可能性。

Sarmistha Talukdar等[6]用冷凍干燥法制得絲素蛋白三維支架，研究了支架與接種細胞的密度之間的相互影響。結果表明，絲素蛋白支架作為一個細胞相容性良好的載體，能夠克服潛在的不足，對細胞的生長和擴增有良好的支持作用。而接種細胞的密度對材料的生物化學和生物力學方面的特性也有顯著地實質性影響，在一定范圍內，密度越大，材料的韌性越好。

Mengqing Zang等[7]通過冷凍干燥法制得了導管狀的絲素—殼聚糖混合支架，將鼠的軟骨細胞接種在支架上，并將支架用一層軟骨膜包裹，培養6周后將所得到的支架—細胞—軟骨膜材料移植到裸鼠背部皮下袋中，試驗結果表明所得的支架—細胞—軟骨膜材料在小鼠體內雖然并未形成類似天然的導管，但該支架材料具有良好的生物相容性，促進細胞的生長和擴增使其具有極好的力學性能，向氣管移植方面研究出類似天然氣管的功能支架材料邁進了一步。

Nandana Bhardwaj等[8]制備了絲素和殼聚糖的多孔聚電解質混合物，電鏡下觀察材料的孔徑為100～160 μm，具有良好的相互連通性，高孔隙率和適宜的抗菌性。與單一材料相比較而言，材料呈現出較高的抗壓強度和彈性模量，且促進貓的成纖維細胞的生長和粘附，具有良好的生物相容性，是一種很有前景的軟骨組織工程材料。

Jiankang He等[9]用自上而下組裝的方法制得絲素—明膠微流體復合支架材料。研究表明SF/G比例為2∶2時，復合材料具有較好的結構特征，機械性能和生物學特性。材料中的微流體孔道在由上而下組裝的過程中保持良好并互相連通。研究設想若將微流體孔道中灌注培養基來提高材料的養分和含氧量，則材料有望用作厚組織工程材料。

2.2 絲素支架材料的細胞相容性

佘榮峰等[10]將兔骨髓間充質干細胞分離培養、誘導后，與絲素蛋白/殼聚糖三維支架材料體外共培養。研究表明，經誘導后的骨髓間充質干細胞在支架材料上黏附、生長良好，材料無細胞毒性，保持正常的分裂增殖速度；隨時間的增加，細胞黏附率增加，材料組較對照組黏附率強。掃描電鏡觀察發現細胞接種48 h后細胞生長良好，與支架黏附緊密，增殖分裂正常。說明絲素蛋白/殼聚糖三維支架材料具有良好的細胞相容性，可以作為軟骨組織工程研究種子細胞的載體。

林靜等[11]用鹽瀝濾法制備三維多孔絲素支架。在絲素多孔支架上培養人成骨肉瘤細胞、成纖維細胞及肝細胞。研究材料的細胞相容性，發現多種動物細胞在鹽瀝濾法所制備的絲素多孔支架材料上能夠很好地黏附和增殖。并通過調整絲素水溶液的濃度、溶解絲素溶劑體系、NaCl添加量和NaCl粒徑，可以改變材料的力學性能、孔隙率、孔壁厚度等，制備出結構和性質可以調控的三維支架。

侯春春[12]以絲素蛋白溶液和自制碳酸鈣為原料，通過調節其共混質量比、采用不同的制備方法，探索絲素蛋白/碳酸鈣復合支架的制備工藝，并對其理化性能和生物相容性進行了相關測試。該試驗中通過急性全身毒性試驗、皮膚致敏試驗、皮內刺激試驗、熱源試驗、溶血試驗、細胞毒性試驗、體外降解率測定等一系列試驗證實，復合支架具有良好的生物相容性，具備發展成為優越的骨組織工程材料的潛力。

Laura J.Bray等[13]制作的雙層絲素支架材料，并在材料上培養角膜緣上皮細胞（L-EC）和角膜緣間質干細胞（L-MSC），比較觀察了兩種細胞在有孔和無孔材料上的生長和表型。研究表明，兩種細胞在有孔材料和無孔材料上生長表現出不同的形態。兩種細胞在雙層絲素支架材料上的生長與單層絲素膜呈現相似的形態，該結果支持由絲素三維支架制備角膜緣的可行性。

Chinmoy Patra等[14]將一種印度柞蠶絲制備絲素蛋白支架用于體外的心臟修復。試驗將三日齡小鼠心室心肌細胞接種于材料上，測試了細胞對材料的粘附性，細胞的代謝活性，細胞對外來刺激的反應，細胞與細胞之間的信息傳遞以及細胞的收縮性。研究表明，絲素蛋白具有與纖連蛋白——心肌細胞基質中的一種成分類似的特性。而且這種柞蠶絲蛋白含有RGD序列，呈現出比普通絲素更優越的性能。因此，該材料有望用于心臟疾病的修復。

Tullia Maraldi等[15]研究了人羊水膜干細胞（AF?SCs）培養在不同多孔支架上時合成礦化細胞外基質的潛力，多孔支架材料分別由膠原蛋白，外消旋聚乳酸和絲素蛋白制備。研究表明，三維的支架材料的應用使AFSCs成骨細胞的分化能力和礦化細胞外基質的產量都明顯高于二維材料。可見AFSCs具有在體內產生三維礦化生物工程材料的巨大潛力，而且絲素蛋白可能是用來修復臨界骨缺損的有效支架材料。

3 結語

絲素蛋白作為一種天然的高分子材料，具有良好的生物相容性，降解性，可改良性和拉伸機械性能等。絲素蛋白是由天然氨基酸疏水段和親水段組成的嵌段復合物，疏水段可通過氫鍵和疏水基團的相互作用形成β-平面或晶體，從而產生較高的力學強度，為絲素支架提供優良的結構相容性。而且，絲素蛋白作為一種良好的細胞生長介質，能夠很好地促進細胞的生長和繁殖，具有良好的細胞相容性。因此，絲素蛋白支架材料在組織工程領域具有很好的開發和應用前景。

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