缺血性腦卒中后Wnt信號通路的時程變化

李艷菲，孫芳玲，艾厚喜，張麗，王文＊

（1.河北北方學(xué)院，石家莊 075000；2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室，教育部神經(jīng)變性病學(xué)重點實驗室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053）

老年病又叫老年疾病，是指人在老年期所患的與衰老有關(guān)并有其自身特點的疾病，常見的有老年性癡呆、老年性精神病、腦動脈硬化以及由此引起的腦卒中等。隨著社會環(huán)境和生活節(jié)奏的變化，世界范圍內(nèi)的腦卒中發(fā)病率明顯升高。我國每年新發(fā)腦卒中超過200萬例，致殘率達75%，發(fā)病率及病死率均高于世界平均水平，尤以缺血性腦卒中的發(fā)病率為高，給家庭和社會帶來了沉重負擔(dān)［1］。腦卒中的病理生理分期不盡一致，綜合文獻報道可分為4期：1）超早期，腦缺血1～6h，病理改變可逆；2）壞死期（急性期）：腦缺血6～48h，病變組織軟化，神經(jīng)元大量消失；3）軟化期（恢復(fù)早期）：腦缺血3～14 d，病變組織液化，神經(jīng)元細胞凋亡，星形細胞增殖；4）恢復(fù)期：腦缺血3～4w后，卒中囊、膠質(zhì)瘢痕等形成，而腦卒中后各個時期中的病理生理變化機制還不清楚。

腦卒中會激活諸如 PI3K／Akt、PKA、JAKSTST、Notch、Wnt／β－catenin、Eph－ephrin等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促使其通過增殖新生細胞而參與腦卒中的干預(yù)和修復(fù)過程。其中Wnt信號通路是研究較早且最為成熟的一條信號通路，它能調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控生物的生長、發(fā)育及胚胎干細胞的增殖、分化、凋亡等重要生理病理過程。而且該信號通路在生物進化過程中極為保守。缺血性卒中后，位于側(cè)腦室下區(qū)的神經(jīng)干細胞會增殖、遷移至缺血邊界區(qū)域以填補受損缺失的神經(jīng)元，即神經(jīng)發(fā)生。研究［2］表明，經(jīng)典 Wnt／β－catenin信號通路在這一過程中起到重要的作用，因此Wnt信號通路相關(guān)因子的時程變化在疾病發(fā)生的進展上有一定的指導(dǎo)意義，但該信號通路在缺血后的具體時程變化及調(diào)節(jié)病理4期的作用不清楚。

藥物對信號通路的影響與其時程變化有很大關(guān)系，藥物可能在缺血后特定環(huán)節(jié)的特定時程上起作用，隨時間推移，其作用可能會減弱或消失，因此時程變化的研究對于缺血性腦卒中后的用藥有重要的指導(dǎo)意義。目前臨床上除了溶栓治療之外，沒有有效的腦保護藥物用于缺血性腦卒中急性期后的干預(yù)治療。因此研究缺血后病理機制的時程變化對于腦卒中的診斷、用藥、研究藥物或指導(dǎo)聯(lián)合用藥在不同的時間上通過激活不同的通路來治療腦卒中有重要的意義。本文就Wnt信號通路相關(guān)因子在缺血性腦卒中后的時程變化及相關(guān)藥物對該信號通路的作用做一綜述，以期為臨床有效治療腦卒中提供理論依據(jù)。

1 Wnt信號通路

Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要有4條：1）由β－連環(huán)蛋白（β－catenin）參與的經(jīng)典途徑；2）通過JNK 介導(dǎo)的Planer細胞極性途徑；3）通過Ca2＋介導(dǎo)的Wnt／Ca2＋途徑，即通過鈣依賴性激酶、鈣調(diào)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子NF－AT起作用的途徑；4）調(diào)節(jié)紡錘體定向和不對稱細胞分裂的途徑。目前研究最多也最為清楚的是 Wnt／β－catenin途徑，即經(jīng)典的 Wnt信號通路。經(jīng)典 Wnt／β－catenin信號傳導(dǎo)通路由配體（Wnt家族蛋白分子）、跨膜受體（Frizzled家族分子和CRP－5／6）、胞漿蛋白（Dsh、APC、Axin、GSK－3β、β－catenin）以及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（TCF／LEF）等組成［3］。其中Wnt蛋白為脂質(zhì)修飾的分泌型蛋白，富含半胱氨酸，目前哺乳動物基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的19種 Wnt基因可劃分為兩大亞族：Wnt－1和 Wnt－5亞族。Wnt－1亞族包括 Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt7a；Wnt5a亞族包括 Wnt4、Wnt5a、Wnt6、Wnt11等。其中 Wnt－1亞族激活經(jīng)典的 Wnt／β－catenin信號通路。

在無Wnt信號刺激時，胞漿內(nèi)的β－catenin大部分與細胞膜上的鈣粘蛋白（E－cadherin）結(jié)合，少部分與 Axin、APC、CK、GSK－3β形成巨大復(fù)合物，該復(fù)合物可以通過磷酸化作用快速降解β－catenin，最終導(dǎo)致胞漿內(nèi)游離β－catenin的水平降低。當(dāng)有Wnt信號刺激時，大量游離的β－catenin在胞質(zhì)中聚集并進入核內(nèi)，從而激活轉(zhuǎn)錄因子，進一步調(diào)控靶基因開始DNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，參與生長、發(fā)育及胚胎干細胞的增殖、分化、凋亡等重要生理病理過程。

研究表明，在正常成年大腦內(nèi)，神經(jīng)干細胞主要存在于海馬齒狀回（DG）和室下區(qū)（SVZ），多種生理病理刺激如腦缺血可誘導(dǎo)腦內(nèi)該特定區(qū)域SVZ和海馬齒狀回顆粒下層（SGZ）內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的激活，進而進行增殖、遷移和分化［4－7］。Zhang RL等［8］用Brdu標(biāo)記腦內(nèi)新生的細胞發(fā)現(xiàn)，大鼠在大腦中動脈閉塞（MCAO）后2～14d，缺血側(cè)SVZ增殖的細胞數(shù)量明顯增加。刑艷等［9］用夾閉小鼠雙側(cè)頸動脈0.5h建立的腦缺血再灌注模型中闡明了 Wnt信號通路與腦缺血后神經(jīng)干細胞的增殖和分化的關(guān)系。

2 缺血性腦卒中后Wnt信號通路相關(guān)因子的時程變化

2.1 Wnt3a

Wnt3a為 Wnt信號通路的起始蛋白，是 Wnt基因家族中的重要成員，其表達增加可激活Wnt信號通路［10］。羅時鵬等［11］通過夾閉雄性昆明小鼠雙側(cè)頸總動脈0.5h再灌的方法建立了腦缺血再灌注模型，并在該模型上研究了Wnt3a在腦缺血再灌注小鼠海馬中的表達變化。原位雜交結(jié)果提示在腦缺血再灌注1、3、7、14、21、28d時，均見 Wnt3a陽性細胞表達，且在再灌注后1d表達開始增加，14d達高峰，28d減少至正常水平［11］。另外，BrdU檢測的海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)干細胞（NSCs）在缺血組再灌注3d時開始增高，7d時達到高峰，隨灌注時間的延長呈下降趨勢，缺血再灌注后28d時，陽性細胞數(shù)降至正常水平。

2.2 Wnt1

Wnt1蛋白是Wnt信號通路中的重要蛋白，是控制細胞生長、增殖的關(guān)鍵分泌信號分子，可傳遞細胞間相互調(diào)控信息。Wnt1在中腦和小后腦的發(fā)育過程中能調(diào)節(jié)特異前體細胞的數(shù)量、維持中腦和小腦區(qū)域正常的組織形態(tài)。正常成年海馬中Wnt1表達極少，信號通路處于關(guān)閉狀態(tài)，神經(jīng)干細胞也處于靜息狀態(tài)，當(dāng)有缺血或損傷的刺激時，Wnt信號會被激活進而通路的相關(guān)因子開始參與神經(jīng)發(fā)生或血管新生的調(diào)控。

在用頸動脈負壓分流法制作的Wistar大鼠腦缺血再灌注模型中，腦缺血再灌注大鼠在3、7、14、21d均有 Wnt－1表達，第3天時Wnt－1反應(yīng)產(chǎn)物開始增多，第7d時表達最強，第14、21天逐漸減少。Wnt－1能時間依賴性地促進神經(jīng)干細胞表達，在神經(jīng)干細胞早期增殖分化中起重要的調(diào)控作用［12］。缺血再灌注大鼠海馬均可見陽性細胞，且在第3天時陽性細胞明顯增多，在第14、21天時逐漸減少。隨著修復(fù)的進行，Wnt1表達逐漸減少，而神經(jīng)干細胞進入分化階段［13］。

2.3 Wnt7b

Wnt7b是哺乳動物早期胚胎發(fā)育的關(guān)鍵樞紐，有研究顯示，Wnt7b在成年雄性Wistar大鼠腦缺血再灌注7d后，海馬SGZ區(qū)陽性細胞表達增多，對側(cè)區(qū)皆較對照組表達顯著增加。Davis等［14］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在出生后7d內(nèi)海馬能表達 Wnt7b和Wnt5a，但尤其高表達 Wnt7b，出生14d后 Wnt7b表達下降。李慧等［15］在用雄性 Wistar大鼠制備的腦缺血再灌注模型中，發(fā)現(xiàn)再灌注后1、3、7、14d的海馬組織中，7d時Wnt7b發(fā)生達高峰，患側(cè)與健側(cè)海馬Wnt7bmRNA水平表達均增強，但患側(cè)更加明顯，且上調(diào)的Wnt7b主要分布于海馬神經(jīng)發(fā)生的SGZ區(qū)域附近［16］。

2.4 β－catenin

β－catenin蛋白是經(jīng)典 Wnt信號通路的關(guān)鍵信號分子，在通路中處于中心地位，它的激活或降解會導(dǎo)致Wnt信號通路的變化。劉斌等［17］用線栓法制備SD雄性大鼠中動脈缺血再灌注模型，在3、6、24、48、72h時間點上發(fā)現(xiàn)與正常組比較，缺血再灌注3 h時β－catenin蛋白表達量升高，再灌注48h時達高峰，72h時開始下降。

2.5 GSK－3β

GSK－3β是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，可通過激活糖元合成酶來調(diào)節(jié)細胞能量代謝，在細胞的生長、分化、突變和凋亡等生命活動中具有重要的調(diào)控作用，是多種信號途徑的交匯點，具有廣泛的底物（包括多種轉(zhuǎn)錄因子），并參與多種信號的負調(diào)控。在劉斌等［17］的實驗中，在3、6、24、48、72h時間點上對GSK－3β的檢測發(fā)現(xiàn)，術(shù)后24h時假手術(shù)組海馬CA1區(qū)可見凋亡陽性細胞；缺血再灌注組3h即出現(xiàn)凋亡細胞，隨著再灌注時間延長逐漸增加，至48h達高峰，72h開始減少。

3 藥物對腦缺血后Wnt信號通路的影響

3.1 舒林酸

舒林酸作為環(huán)氧合酶抑制劑及非甾體類抗炎藥具有良好的抗炎性能。越來越多的證據(jù)表明，炎癥反應(yīng)在腦缺血后損傷擴大化的過程中發(fā)揮著重要的作用。邢艷等［18］在成年SD大鼠永久性大腦中動脈閉塞的模型上發(fā)現(xiàn)，造模前30min給予舒林酸20 mg／kg，可使 Wnt／β－catenin信號通路的 APC和βcatenin明顯上調(diào)，并且使大鼠的神經(jīng)功能得以改善，梗死體積和腦水腫都有所降低，這提示舒林酸能激活Wnt信號通路進而對缺血性腦卒中引起的急性期損傷起到神經(jīng)保護作用。

3.2 紅景天苷

紅景天苷是紅景天的主要有效成分，局灶性腦缺血再灌注動物實驗［19］顯示，紅景天苷具有減輕氧化應(yīng)激性、抑制腦水腫、減輕炎性反應(yīng)等多種神經(jīng)保護作用。張犁等［20］在用四血管閉塞法建立的SD大鼠全腦缺血模型上發(fā)現(xiàn)，造模后6、24、72h和7d時連續(xù)灌胃給藥7d，神經(jīng)功能均有顯著改善，其中72h和7d開始給藥7d時紅景天苷對神經(jīng)功能的改善較為顯著。朱曉娟等［21］用小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）系D1細胞研究了紅景天苷如何通過Wnt／β－catenin信號通路影響神經(jīng)細胞定向分化的機制。紅景天苷誘導(dǎo)12、24、48和72h后，實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，紅景天苷誘導(dǎo)MSCs在這幾個時間點均能促進 Wnt／β－catenin信號通路中關(guān)鍵信號分子 Wnt3a和GSK－3βmRNA的表達，并且其表達量根據(jù)誘導(dǎo)時間不同而有差異。蛋白免疫印跡表明，紅景天苷誘導(dǎo)D1細胞12h和24h時βcatenin蛋白的表達明顯上調(diào)，隨作用時間延長，GSK－3β蛋白的表達增加。

紅景天苷能通過誘導(dǎo) Wnt／β－catenin信號通路的激活來調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的分化，據(jù)此推斷，紅景天苷很有可能通過激活 Wnt／β－catenin信號通路來調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞分化進而對治療缺血性腦損傷有重要的藥效學(xué)指導(dǎo)作用。

3.3 補腎陽中藥

中醫(yī)理論認為腎陽主要有促進機體溫煦、運動、興奮和化氣的功能。腎藏精，主骨生髓，腎陽對人的生命至關(guān)重要。補腎陽中藥能增強機體的免疫功能，改善損傷機體神經(jīng)系統(tǒng)功能。

中藥右歸丸、淫羊藿是溫補腎陽的中藥，大量的文獻報道［22］證實了淫羊藿及其活性成分淫羊藿苷具有促進細胞增殖分化、提高堿性磷酸酶活性、抑制細胞凋亡等作用。秦夢等［23］利用從給予右歸丸、淫羊藿和淫羊藿苷的SD大鼠心臟處取得的含藥血清做培養(yǎng)基，研究乳鼠成骨細胞 Wnt／β－catenin信號通路相關(guān)蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)在1、3、5、7、9d中，右歸丸在5、7、9d時能顯著提高 Wnt3a、Wnt7b、βcatenin蛋白的表達［23］，淫羊藿和淫羊藿苷除在7、9 d時能提高 Wnt7b蛋白表達外，并未明顯促進Wnt3a和β－catenin蛋白的表達。可見，補腎陽中藥在通過Wnt／β－catenin信號通路治療缺血性腦損傷的研究中也體現(xiàn)出了重要作用。

3.4 其他

3.4.1 重組 Wnt3a 在由血管收縮劑內(nèi)皮素－1誘導(dǎo)引起的小鼠局灶性腦缺血模型中，當(dāng)用慢病毒介導(dǎo)的Wnt3a注射到紋狀體或SVZ時，未成熟神經(jīng)元在紋狀體和SVZ區(qū)的數(shù)量都有增加，且能顯著增強缺血區(qū)紋狀體神經(jīng)功能的恢復(fù)。當(dāng)慢病毒介導(dǎo)的Wnt3a注射到SVZ區(qū)時，從第2天起就有神經(jīng)功能障礙恢復(fù)的跡象，注射到紋狀體時作用時間能持續(xù)到28d，說明Wnt信號通過增加神經(jīng)再生和神經(jīng)元在紋狀體和SVZ區(qū)的存活來促進局灶性腦損傷功能的恢復(fù)［24］。

3.4.2 α－黑素細胞刺激素 α－黑素細胞刺激素（α－MSH）來源于阿黑皮素原（POMC），是一種由13個氨基酸構(gòu)成的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)肽。POMC是一種肽激素前體，主要在垂體、腦以及外周表達，經(jīng)翻譯后可產(chǎn)生一系列有生物活性而又功能各異的激素即黑皮質(zhì)激素。內(nèi)源性黑皮質(zhì)素在生理水平有保護和恢復(fù)神經(jīng)功能的作用，其通過黑皮質(zhì)素受體4（MCR4）發(fā)揮作用。MCR4屬于G蛋白偶聯(lián)受體，具有七次跨膜結(jié)構(gòu)，一方面受外界激動劑或拮抗劑的調(diào)節(jié)，另一方面，活化后會影響細胞內(nèi)的信號調(diào)節(jié)通路。黑皮質(zhì)素受體激動劑誘導(dǎo)腦缺血后神經(jīng)保護、促進神經(jīng)再生、增加海馬區(qū)新生細胞的數(shù)量，使其向成熟和功能神經(jīng)元分化并保持完整持續(xù)的功能恢復(fù)作用。黑皮類似物－黑素細胞刺激激素（NDP－α－MSH）能增加海馬齒狀回顆粒下層β－catenin的表達，新生細胞在第3、10天的時候表達量增多，第10天時神經(jīng)元減少降低［25－27］。

3.4.3 鋰 鋰是用來治療躁郁癥的基本藥物，近年來它在腦卒中以及神經(jīng)退行性疾病中的神經(jīng)保護作用已被證實。鋰能通過抑制GSK－3β來激活 Wnt信號通路，從而刺激海馬神經(jīng)前體細胞的增殖，促進神經(jīng)再生［28］。Yu F 等［29］用 C57BL／6小鼠制備的腦損傷模型，在損傷后15min開始給予1.5mEq／kg，連續(xù)給藥2w，對第3、21天的腦梗死體積及神經(jīng)功能測定，發(fā)現(xiàn)兩個時間點均能減少腦梗死面積，且腦損傷后3d時的神經(jīng)元死亡、小膠質(zhì)細胞活化和環(huán)氧合酶－2誘導(dǎo)的相關(guān)性都有所減少。此外，鋰還能保持血腦屏障的完整性，抑制腦損傷引起的神經(jīng)炎性，減輕焦慮樣行為，改善短期和長期的運動協(xié)調(diào)。

另外，由于GSK－3β在 Wnt信號通路里具有重要的生理功能，通過使用小分子來抑制它的磷酸化活性進而激活Wnt信號通路來治療缺血性腦損傷將成為一個研究的熱點。目前已有多種小分子物質(zhì)顯示出較好的抑制作用，如雙吲哚靛玉紅、馬來酰胺等［30］。

4 小結(jié)與展望

老年病不同于其他疾病的基本界限在于致病因素與機體的衰老密不可分，雖然腦缺血卒中后的神經(jīng)元再生為其治療帶來了新希望，但神經(jīng)發(fā)生的過程短暫而微弱。如何有效誘導(dǎo)腦缺血損傷后神經(jīng)祖／干細胞增殖、遷移到損傷區(qū)分化為神經(jīng)元，并與固有神經(jīng)通路進行功能性整合，是研究腦缺血損傷修復(fù)和保護手段的熱點。尤其在腦損傷后合理的時程范圍內(nèi)給予外源性藥物激活特定信號通路，促進內(nèi)源性神經(jīng)元的再生或延長再生修復(fù)的時間將是藥物臨床前研究的重點。本文對老年病相關(guān)的缺血性卒中后神經(jīng)再生相關(guān)的Wnt信號通路時程變化研究進行了總結(jié)，發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路在缺血性腦損傷的超早期可能不被激活，在急性期和恢復(fù)期早期的表達可能與其代償性彌補神經(jīng)元的丟失相關(guān)，而恢復(fù)期的不表達可能與機體的自我修復(fù)作用相關(guān)，這對腦卒中治療藥物的研發(fā)有重要意義。目前已有研究利用Wnt信號通路抑制因子Dkk－1的拮抗劑［31］來促進細胞再生，具有潛在的治療腦卒中及老年病的價值。重組Wnts或Wnt類似物、纖維樣生長因子［32－34］也將會是腦卒中的新保護途徑。另外，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，今后還可結(jié)合新的技術(shù)，確定特定細胞靶點或進行系統(tǒng)性干預(yù)，甚至通過與其他信號通路交叉分子如Notch類似物等［35］的研究來豐富Wnt信號通路激動劑藥物的開發(fā)，進而為老年病的治療提供新的途徑。

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