常用阿爾茨海默病動物模型制備方法及評價

楊翠翠，李林，張?zhí)m

（首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100053）

阿爾茨海默病（Alzheimer＇s disease，AD）又稱老年性癡呆，是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是臨床較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變［1］。其腦部典型的病理改變?yōu)樯窠?jīng)元丟失，細(xì)胞外有大量由β－淀粉樣蛋白（βamyloid，Aβ）組成的老年斑（senile plaques，SP）、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維絲纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）等［1］。

目前，AD動物模型的建立有很多種，但每種動物模型均有局限性，并不能完全模擬AD的病理特征。該文對AD研究中常用動物模型進(jìn)行綜述并對各類模型的優(yōu)缺點進(jìn)行評價。

1 以Aβ為基礎(chǔ)的動物模型

Aβ是老年斑的主要組成成分。Aβ是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素［2，3］。

1.1 APP轉(zhuǎn)基因小鼠及APP／PS－1雙轉(zhuǎn)基因小鼠

淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）基因突變時，β－APP主要由β－2分泌酶和γ－2分泌酶作用裂解為 Aβ［4，5］，Aβ聚集可形成神經(jīng)毒性的原纖維，進(jìn)而形成SP，從而加重AD的發(fā)展。轉(zhuǎn)APP基因模型是通過將外源性APP基因?qū)耄系交蚪M中后穩(wěn)定的表達(dá)并遺傳給后代。由于動物過多表達(dá)APP基因或其突變基因，導(dǎo)致Aβ沉積。1）Tg2576小鼠是轉(zhuǎn)人類APP695基因小鼠，6～8月時腦內(nèi)Aβ開始升高，10個月左右可見Aβ沉積，神經(jīng)炎斑形成，且隨年齡增加而加重，同時發(fā)現(xiàn)突觸丟失和小膠質(zhì)細(xì)胞增生［6］。此外，Tg2576小鼠Aβ淀粉變性可誘導(dǎo)tau蛋白聚積，使其空間記憶能力下降，對移位物體分辨能力降低［7］。2）APP23小鼠由轉(zhuǎn)人類APP695鼠和APP V717I鼠交配得來，3個月時出現(xiàn)空間記憶障礙，6個月時已有Aβ沉積，24個月時在皮質(zhì)和海馬出現(xiàn)大量Aβ，并且隨著年齡增長Aβ出現(xiàn)數(shù)量和體積增多［8］。3）APPswe／PS－1雙轉(zhuǎn)基因小鼠可表達(dá)人突變的PS－1（M146L）基因和APP（K670N，671N）基因，該轉(zhuǎn)基因小鼠在12w后，其皮層和海馬可見Aβ沉積，沉積隨年齡逐漸增加［9］。該模型主要應(yīng)用于研究PS－1在Aβ沉積中的作用。9個月時，轉(zhuǎn)基因鼠活動次數(shù)減少，空間記憶能力降低［10］。

評價：APP轉(zhuǎn)基因小鼠及APP／PS－1雙轉(zhuǎn)基因小鼠是目前國際最為認(rèn)可的AD動物模型，是AD藥效學(xué)評價的金標(biāo)準(zhǔn)。但其造價昂貴，成模周期較長，一定程度上制約了該模型的廣泛應(yīng)用。

1.2 Aβ注射擬AD動物模型

由于轉(zhuǎn)基因動物成本高，試驗周期較長，腦內(nèi)注射Aβ建立擬癡呆模型可一定程度替代轉(zhuǎn)基因模型用于研究Aβ與AD發(fā)病的關(guān)系及藥物干預(yù)。體外實驗表明Aβ在1mol濃度時即對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用。腦內(nèi)注射Aβ可使動物產(chǎn)生與AD相似的行為障礙和記憶缺損癥狀，Aβ沉積，氧化應(yīng)激損傷等［11］。注射Aβ是目前較常用的一種擬AD動物模型［12，13］，其制備方法有海馬內(nèi)單點注射、海馬內(nèi)多點注射、側(cè)腦室注射等。大鼠左側(cè)側(cè)腦室一次性注射聚集態(tài)的Aβ25－35，可以造成大鼠空間記憶能力降低，膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，但并未有典型NFTs的形成［14，15］；Yamaguchi等［16］采用大鼠側(cè)腦室內(nèi)一次性注射聚集態(tài)Aβ25－35，發(fā)現(xiàn)AD模型大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙。

評價：該模型成本少，試驗周期較轉(zhuǎn)基因動物短，可用于探討Aβ在AD中的發(fā)病機制。不足：1）對動物導(dǎo)入Aβ時，注射本身將對腦組織形成局灶性穿透性損傷；2）大量的Aβ聚集在注射位點局部而不是彌散地分布到腦內(nèi)。

2 以tau蛋白過度磷酸為基礎(chǔ)的模型

2.1 抑制tau蛋白磷酸酶（protein phosphatases，PPs）所致tau蛋白磷酸化模型及激活tau蛋白激酶所致tau蛋白磷酸化模型

Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，具有穩(wěn)定微管，促進(jìn)微管裝配的功能。異常過度磷酸化的tau蛋白是NFTs的核心。目前認(rèn)為tau蛋白磷酸化是體內(nèi)多種蛋白激酶，如糖原合成酶激酶－3（GSK－3）、周期蛋白依賴性激酶－5（cdk－5）、蛋白激酶 A（PKA）等引起的磷酸化和PPs去磷酸化兩種作用失調(diào)所導(dǎo)致。根據(jù)以上原理，目前的動物模型制作主要分為抑制tau PPs所致tau蛋白磷酸化模型及激活tau蛋白激酶所致tau蛋白磷酸化模型。

岡田酸（okadaicacid，OA）是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白磷酸酯酶抑制劑，是PP1和PP2A的抑制劑。將OA注射到大鼠側(cè)腦室或者海馬均可導(dǎo)致大鼠空間記憶力下降以及tau蛋白在ser396、ser199／202、ser404 等 位 點 的 磷 酸 化 顯 著 增 加［17，18］。Wortmannin（WT）能夠抑制磷脂酰肌醇3激酶抑制劑（PI3K）的活性，從而抑制GSK－3β在ser9位點的磷酸化而導(dǎo)致GSK－3β活性增高，因此 WT造模可以導(dǎo)致大鼠空間記憶力下降，GSK－3β活性增加，tau蛋白在ser396／404和ser199／202等位點的磷酸化［19］。該模型只有tau蛋白高度磷酸化的表現(xiàn)，沒有Aβ的病理表現(xiàn)。

評價：以上兩種模型成模周期短，只有tau蛋白的病理表現(xiàn)，適合研究tau蛋白磷酸化相關(guān)的機制及拮抗tau蛋白磷酸化為靶標(biāo)的藥物作用機制。但造模方式較為復(fù)雜，需定位準(zhǔn)確，工具藥藥量適中。

2.2 轉(zhuǎn)人類tau蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物

為了闡明tau蛋白在AD病理過程中的發(fā)生機制，一些學(xué)者構(gòu)建了轉(zhuǎn)人類tau蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物，主要有P301L、轉(zhuǎn)人類野生型tau基因小鼠，其中P301L包括JNPL3與rTg4510。P301L出現(xiàn)神經(jīng)元丟失和NFTs，但不會出現(xiàn)Aβ淀粉樣斑塊，90%的動物會存在輕度運動功能障礙，在動物腦干、小 腦 和 脊 髓 中 均 可 見 NFTs［20，21］。 相 比 之 下，Ishihara等［22］在過表達(dá)人類最小tau蛋白片段轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬、扁桃體、內(nèi)嗅皮質(zhì)形成congophilic tau，并首次檢測出類NFTs的特定的并與β折疊片層結(jié)構(gòu)結(jié)合的包涵物。Andorfer［23］在過表達(dá)人類tau蛋白片段轉(zhuǎn)基因小鼠（tau蛋白基因敲除）中發(fā)現(xiàn)，6個月后在皮層、海馬部位出現(xiàn)tau蛋白磷酸化和NFTs，在紋狀體，小腦和脊髓中較少或無tau蛋白磷酸化和NFTs的產(chǎn)生，這與人類AD的病理變化相似。此鼠15個月出現(xiàn)神經(jīng)元丟失，與P301L不同的是，不出現(xiàn)運動功能的變化。

評價：轉(zhuǎn)基因動物發(fā)病時間長，在多個腦區(qū)出現(xiàn)tau蛋白磷酸化和NFTs，一定程度上模擬了人類AD病理變化和行為學(xué)改變特征。但存在成本高、外源基因不穩(wěn)定等問題。

3 同時表達(dá)Aβ和NFTs的動物模型

隨著實驗技術(shù)的完善和進(jìn)步，出現(xiàn)了同時表達(dá)AD的兩大典型病理變化Aβ和NFTs的轉(zhuǎn)基因動物。Oddo等分別把兩種突變基因 APP－Swe和tauP301L顯微注射入單轉(zhuǎn)PS1M146V基因鼠純合子的胚胎干細(xì)胞中，經(jīng)篩選得到3xTg－AD小鼠。該轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)逐漸出現(xiàn)SP和NFTs，長時程增強電位隨年齡增長而逐漸下降，這一改變出現(xiàn)在SP和 NFTs形成之前［24－26］。

評價：多種轉(zhuǎn)基因組合方法全面模擬了AD主要病理變化和行為學(xué)改變特征。轉(zhuǎn)基因動物的缺點在于難以重復(fù)、外源性基因表達(dá)不穩(wěn)定、繁殖能力低下、抵抗疾病能力差、成本昂貴等問題。但是轉(zhuǎn)基因動物模型更能全面模擬AD發(fā)病的過程，具有廣闊的應(yīng)用前景，在越來越多的研究中得到應(yīng)用。

4 膽堿能損傷動物模型

膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)是腦內(nèi)重要的化學(xué)物質(zhì)，它沿著中膈、海馬、基底前腦系統(tǒng)投射到皮質(zhì)，傳導(dǎo)沖動反復(fù)出現(xiàn)，使之有可能學(xué)習(xí)新的知識。AD患者腦中膽堿能神經(jīng)元缺失、突觸前乙酰膽堿的合成降低、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性和對膽堿的攝取能力明顯下降，這些變化與患者的認(rèn)知功能損害程度呈正相關(guān)［27］。因此通過破壞動物大腦的膽堿能系統(tǒng)，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙而制作AD動物模型。

4.1 物理手段致膽堿能損傷模型

此動物模型主要通過損毀海馬傘使動物出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶功能障礙而建立。Hefti等［28］通過切斷海馬傘的方式造成膽堿能神經(jīng)元丟失及動物空間定向和記憶障礙。此外，通過電損傷Meynert基底核也可導(dǎo)致動物大腦皮層乙酰膽堿含量明顯降低，從而破壞動物學(xué)習(xí)記憶能力。

評價：采用該方法建立動物模型周期較短，但手術(shù)定位困難，難免損傷手術(shù)附近部位。

4.2 化學(xué)手段致膽堿能損傷模型

此AD模型主要采用化學(xué)手段破壞膽堿能系統(tǒng)建立。大鼠腹腔注射東莨菪堿及樟柳堿（膽堿能拮抗劑）后，可阻斷動物大腦皮層中乙酰膽堿受體的結(jié)合位點，引起膽堿能系統(tǒng)功能障礙［29］。

另外，通過腦室或核周內(nèi)注射某些神經(jīng)毒素?fù)p害特定區(qū)域的神經(jīng)元，可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力降低和膽堿能功能喪失。興奮性氨基酸主要有：海人酸（KailllCaeid，KA）、鵝 膏 覃 氨 酸 （Ibotenicaeid，IBO）、N－甲基－D－天門冬氨酸（NMDA）、使君子酸等，注入大鼠 Meynert基底核可建立AD模型［30］。此法可導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)元減少、皮質(zhì)膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶（ChAT）活性降低，但不破壞通過此區(qū)域的神經(jīng)纖維。

評價：該模型可復(fù)制AD膽堿能功能減退的特征性病理變化，是AD藥物評價常用的動物模型。制模時需在應(yīng)用的藥物種類、劑量、作用部位及時間等方面優(yōu)化條件，才能獲得比較理想的模型病理狀態(tài)。該模型不出現(xiàn)AD的典型病理改變——老年斑和NFTs，因此只能應(yīng)用于膽堿能系統(tǒng)的機制研究及藥物評價。

5 衰老動物模型

AD是一個與年齡密切相關(guān)的疾病，衰老因素在AD發(fā)病過程中起著重要作用。隨著世界人口老齡化加重，AD的患病率明顯上升，給患者和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。以衰老為AD發(fā)病基礎(chǔ)的動物模型成為實驗研究中不可或缺的部分。

5.1 自然衰老動物

通過動物的自然衰老獲得AD動物模型，包括老齡化小鼠、大鼠、猴及狗等。此模型的認(rèn)知功能障礙等神經(jīng)系統(tǒng)改變是自然發(fā)生的，與AD真實的病理生理改變更為接近［31］。大鼠、小鼠及猴是自然衰老模型中較為常用的動物。老年大鼠、小鼠及猴出現(xiàn)突觸缺失、膽堿能神經(jīng)元減少、Aβ沉積等病理變化［32，33］

近年來研究表明，老年狗能夠出現(xiàn)類似AD的記憶力障礙，但是缺少檢測狗記憶力障礙的合適手段。Salvin等［34］最近研發(fā)出一種sand maze用來檢測狗空間記憶能力，并發(fā)現(xiàn)老年狗穿越目標(biāo)區(qū)域次數(shù)明顯低于青年狗。

評價：1）AD是一種不同于正常衰老的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，故老齡動物有其局限性，只是模擬了部分與人類正常衰老相關(guān)的神經(jīng)變化改變，并不能全面模擬AD的變化。2）飼養(yǎng)周期和實驗周期長、病死率高等缺點，大大限制了該模型的應(yīng)用。

5.2 快速老化小鼠（senescence accelerated mouse，SAM）模型

SAMP8小鼠與自然衰老小鼠相似，有類似老年癡呆腦部病理改變及學(xué)習(xí)記憶功能降低的變化［35］，但與自然衰老小鼠或者大鼠相比，其出現(xiàn)類似AD腦內(nèi)病理變化較早。有研究表明，10月齡SAM鼠與22月齡wistar大鼠均能出現(xiàn)氧化損傷、炎癥反應(yīng)及凋亡［36］。1～5月齡的SAMP8鼠腦內(nèi)即出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化，氧自由基增加，學(xué)習(xí)記憶力損傷等變化［37］。在5月齡的時候，與SAMR1相比，SAMP8鼠腦內(nèi)出現(xiàn)tau蛋白高度磷酸化，其中海馬、皮層、紋狀體較為明顯，小腦內(nèi)無tau蛋白高度磷酸化［38］。

評價：該模型衰老時間短，出現(xiàn)AD腦內(nèi)病理變化早，縮短研究周期。缺陷：1）SAMP8小鼠與AD發(fā)病過程和機制是否一致有待進(jìn)一步研究；2）實驗成本高；3）SAMP8小鼠壽命短，不適合用于長周期的實驗。

5.3 D－半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老動物模型

注射D－半乳糖誘導(dǎo)后，動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)可出現(xiàn)例如動物學(xué)習(xí)能力下降，神經(jīng)細(xì)胞病理改變，神經(jīng)元丟失，線粒體腫脹呈空泡狀等退行性病變，與老年動物腦內(nèi)病理變化表現(xiàn)一致，故其常作為抗衰老藥物研究模型［39］。羅煥敏等［40］將NIH小鼠腹腔注射D－半乳糖120mg／kg連續(xù)60d，小鼠大腦皮層出現(xiàn)類老年斑的病理改變，在海馬區(qū)可見神經(jīng)元變性壞死。但此類模型未出現(xiàn)NTFs及老年斑樣改變。

6 損傷線粒體動物模型

線粒體異常的氧化磷酸化，尤其是COX在AD發(fā)病中的作用引起了人們的重視。多項研究表明，AD患者線粒體內(nèi)COX活性明顯減少且較為特異［41－45］。Mosconi利用正電子斷層掃描（Positron Emission Tomography，PET）檢查顯示AD患者腦組織氧化和能量代謝受損，主要表現(xiàn)為腦顳部及頂部葡萄糖利用（glucose utilization，GU）減少［46］。目前研究發(fā)現(xiàn)采用NaN3可造成動物學(xué)習(xí)記憶障礙。采用微泵長期、緩慢、恒速地在大鼠皮下灌注一定濃度的NaN3后進(jìn)行Morris水迷宮實驗，測定后發(fā)現(xiàn)其空間學(xué)習(xí)記憶能力受到損傷，holeboard迷宮實驗結(jié)果也表明其存在空間記憶保持的缺陷［47］。有學(xué)者研究表明，微泵恒速皮下灌注NaN31mg／（kg·h），30d 即 可 出 現(xiàn) 學(xué) 習(xí) 記 憶 障 礙（Morris水迷宮和避暗反應(yīng)），但不引起大鼠興奮性、新異環(huán)境感知和緊張情緒的改變（曠場分析）；增加劑量致2mg／（kg·h），模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙加重，且出現(xiàn)興奮性，新異環(huán)境感知和緊張情緒的異常。此模型大鼠腦內(nèi)可出現(xiàn)ChAT活性降低和海馬神經(jīng)元損傷。

評價：此模型模擬AD長時程、進(jìn)行性惡化的發(fā)病特點。NaN3有毒性，造模時需要對其用量及實驗操作手段嚴(yán)格要求。此外，造模所用微泵價格昂貴，造模成本較高。

7 結(jié)語

目前常用的AD動物模型多為針對特定發(fā)病機制和靶點而制備，因此多數(shù)模型只能模擬AD諸多病理變化中的一個側(cè)面，而不能全面體現(xiàn)AD的病理、生化及神經(jīng)行為學(xué)等方面的全部變化特征。我們應(yīng)根據(jù)不同的實驗?zāi)康倪x擇合適的模型。隨著對AD發(fā)病分子機制認(rèn)識的不斷深入，能模擬AD多個發(fā)病環(huán)節(jié)及病理進(jìn)程的新動物模型將不斷出現(xiàn)。

［1］莊瑩，陳杰.阿爾茨海默病病因及發(fā)病機制研究進(jìn)展［J］.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2008，29（2）：101－104.

［2］Lu YL，Lu K，Chen ZM，et al.Changes of neuropeptide in serum and CSF of muti－infarct dementic patient［J］.Di－si Junyi Daxue Xuebao：J Fourth Mil Med Univ，2001，22（6）：566－567.

［3］呂俊華，郭晶，楊文豪.綠茶多酚對D－半乳糖Aβ25－35誘導(dǎo)的AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用［J］.中藥材，2006，29（4）：352－354.

［4］巴根，湯雋，張進(jìn).阿爾茨海默病發(fā)病機制的相關(guān)研究進(jìn)展［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2006，9（11）：937－938.

［5］Gordon MN，King DL，Diamond DM，et al.Correlation between cognitive deficits and Abeta deposits in transgenic APP＋PS1mice［J］.Neuroboil Ageing，2001，22（3）：377－385.

［6］Kawarabayashi T，Younkin LH，Saido TC，et al.Agedependent changes in brain，CSF，and plasma amyloidβ protein in the Tg2576transgenic mouse model of Alzheimer＇s disease［J］.J Neurosci，2001，21（2）：372－381.

［7］Ognibene E，Middei S，Daniele S，et al.Aspects of spatial memory and behavioral disinhibition in Tg2576transgenic mice as a model of Alzheimer＇s disease［J］.Behav Brain Res，2005，156（2）：225－232.

［8］Kelly PH，Bondolfi L，Hunziker D，et al.Progressive agerelated impairment of cognitive behavior in APP23transgenic mice［J］.Neurobiol Aging，2003，24（2）：365－378.

［9］Su D，Zhao Y，Xu H，et al.Isoflurane exposure during midadulthood attenuates age－related spatial memory impairment in APP／PS1transgenic mice［J］.PloS one，2012，7（11）：e50172.

［10］Ferguson SA，Sarkar S，Schmued LC.Longitudinal behavioral changes in the APP／PS1transgenic Alzheimer＇s Disease model［J］.Behav Brain Res，2013，242：125－134.

［11］Tian X，Wang J，Dai J，et al.Hyperbaric oxygen and Ginkgo Biloba extract inhibit Aβ25－35－induced toxicity and oxidative stress in vivo：apotential role in Alzheimer＇s disease［J］.Int J Neurosci，2012，122（10）：563－569.

［12］Giménez－Llort L，Blázquez G，Ca?ete T，et al.Modeling behavioral and neuronal symptoms of Alzheimer′s disease in mice：a role for intraneuronal amyloid［J］.Neurosci Biobehav Rev，2007，31（1）：125－147.

［13］Lord A，Kalimo H，Eckman C，et al.The Arctic Alzheimer mutation facilitates early intraneuronal Abeta aggregation and senile plaque formation in transgenic mice［J］.Neurobiol Aging，2006，27（1）：67－77.

［14］楊曉娟，張生林，陳蕓，等.新型復(fù)合式老年癡呆動物模型的建立［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2006，4（4）：318－320.

［15］Lee YW，Kim DH，Jeon SJ，et al.Neuroprotective effects of salvianolic acid B on an Aβ25－35peptide－induced mouse model of Alzheimer＇s disease［J］.Eur J Pharmacol 2013，704（1－3）：70－77.

［16］Yamaguchi Y，Kawashima S.Effects of amyloid－β－25－35on passive avoidance，radial－arm maze learning and choline acetyltransferase activity in the rat［J］.Eur J Pharmacol，2001，412（3）：265－272.

［17］白娟，張生林，楊寧寧，等.吡格列酮對AD大鼠模型學(xué)習(xí)記憶及 GSK－3β、p－tau蛋 白 的 影 響 ［J］.中 國 醫(yī) 療 前 沿，2010，5（21）：28－29.

［18］Li L，Liu J，Yan X，et al.Protective effects of ginsenoside Rd against okadaic acid－induced neurotoxicity in vivo and in vitro［J］.J Ethnopharmacol，2011，138（1）：135－141.

［19］Liu SJ，Zhang AH，Li HL，et al.Overactivation of glycogen synthase kinase－3by inhibition of phosphoinositol－3kinase and protein kinase C leads to hyperphosphorylation of tau and impairment of spatial memory［J］.J Neurochem，2003，87（6）：1333－1344.

［20］王艷艷，陳汝筑，朱小南，等.含P301L突變的Tau轉(zhuǎn)基因小鼠純合子品系的建立及鑒定［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2012，28（3）：221－224.

［21］Mustroph ML，King MA，Klein RL，et al.Adult－onset focal expression of mutated human tau in the hippocampus impairs spatial working memory of rats［J］.Behav Brain Res，2012，233（1）：141－148.

［22］Ishihara T，Zhang B，Higuchi M，et al.Age－Dependent Induction of Congophilic Neurofibrillary Tau Inclusions in Tau Transgenic Mice［J］.Am J Pathol，2001，158（2）：555－562.

［23］Andorfer C， Kress Y， Espinoza M， et al.Hyperphosphorylation and aggregation of tau in mice expressing normal human tau isoforms［J］.J Neurochem，2003，86（3）：582－590.

［24］Oddo S，Caccamo A，Shepherd JD，et al.Triple－transgenic model of Alzheimer＇s disease with plaques and tangles：intracellular Aβand synaptic dysfunction［J］.Neuron，2003，39（3）：409－421.

［25］Stieler JT，Bullmann T，Kohl F，et al.The physiological link between metabolic rate depression and tau phosphorylation in mammalian hibernation［J］.PloS one，2011，6（1）：e14530.

［26］Wang LL，Na X，Zhu XN，et al.Generation of Tau／App／PS1 triple－transgenic mouse model and the study of its biological characteristics［J］.Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi.2012，28（4）：294－297

［27］Whitehouse PJ.Cholinergic therapy in dementia［J］.Acta Neurol Scand Suppl，1993，149：42－45.

［28］Hefti F，Dravid A，Hartikka J.Chronic intraventricular injections of nerve growth factor elevate hippocampal choline acetyltransferase activity in adult rats with partial septohippocampal lesions［J］.Brain Res，1984，293（2）：305－311.

［29］楊軍，王靜.腦康泰膠囊對小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2000，11（1）：29－31.

［30］Scali C，Prosperi C，Vannucchi MG，et al.Brain inflammatory reaction in an animal model of neuronal degeneration and its modulation by an anti－inflammatory drug：implication in Alzheimer＇s disease［J］.Eur J Neurosci，2000，12（6）：1900－1912.

［31］Woodruff－Pak DS，Trojanowski JQ.The older rabbit as an animal model：Implications for Alzheimer＇s disease［J］.Neurobiol Aging，1996，17（2）：283－290.

［32］Mostany R，Anstey JE，Crump KL，et al.Altered synaptic dynamics during normal brain aging［J］.J Neurosci，2013，33（9）：4094－4104.

［33］Ni C，Tan G，Luo A，et al.Melatonin Premedication Attenuates Isoflurane Anesthesia－Induced β－Amyloid Generation and Cholinergic Dysfunction in the Hippocampus of Aged Rats［J］.Int J Neurosci，2013，123（4）：213－220.

［34］Salvin HE，McGreevy PD，Sachdev PS，et al.The canine sand maze：an appetitive spatial memory paradigm sensitive to agerelated change in dogs［J］.J Exp Anal Behav，2011，95（1）：109－118.

［35］Butterfield DA，Poon HF.The senescence－accelerated prone mouse（SAMP8）：a model of age－relatedcognitive decline with relevance to alterations of the gene expression and proteinabnormalities in Alzheimer＇s disease［J］.Exp Gerontol，2005，40（10）：774－783.

［36］Tresguerres JA，Kireev R，F(xiàn)orman K，et al.Effect of chronic melatonin administration on several physiological parameters from old Wistar rats and SAMP8mice［J］.Curr Aging Sci，2012，5（3）：242－253.

［37］Sun CY，Qi SS，Zhou P，et al.Neurobiological and pharmacological validity of curcumin in ameliorating memory performance of senescence－accelerated mice［J］.Pharmacol Biochem Behav，2013，105：76－82.

［38］Canudas AM，Gutierrez－Cuesta J，Rodríguez MI，et al.Hyperphosphorylation of microtubule－associated protein tau in senescence－accelerated mouse（SAM）［J］.Mech Ageing Dev，2005，126（12）：1300－1304.

［39］Shang YZ，Gong MY，Zhou XX，et al.Improving effects of SSF on memory deficits and Pathological changes of neural and immunological systems in senescent mice［J］.Acta Pharmacol Sin，2001，22（12）：1078－1083.

［40］羅煥敏，陳子晟.一種新的老年癡呆動物模型［J］.中國老年學(xué)雜志，2003，3（23）：179－182

［41］Parker WD Jr，F(xiàn)illey CM，Parks JK.Cytochrome oxidase deficiency in Alzheimer′s disease ［J］.Neurology，1990，40（8）：1302－1303.

［42］Parker WD Jr，Mahr NJ，F(xiàn)illey CM，et al.Reduced platelet cytochrome c oxidase activity in Alzheimer′s disease［J］.Neurology，1994，44（6）：1086－1090.

［43］Mutisya EM，Bowling AC，Beal MF.Cortical cytochrome oxidase activity is reduced in Alzheimer′s disease ［J］.J Neurochem，1994，63（6）：2179－2184.

［44］Parker WD Jr，Parks JK.Cytochrome c oxidase in Alzheimer′s disease brain：purification and characterization［J］.Neurology，1995，45（3Pt 1）：482－486.

［45］李子艷，馬慧冬.阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠的行為學(xué)檢測方法［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8（16）：13－15.

［46］Mosconi L.Brain glucose metabolism in the early and specific diagnosis of Alzheimer＇s disease.FDG－PET studies in MCI and AD［J］.Eur J Nucl Med Mol Imaging，2005；32（4）：486－510.

［47］Callaway NL，Riha PD，Wrubel KM，et al.Methylene blue restores spatial memory retention impaired by an inhibitor of cytochrome oxidase in rats［J］.Neurosci Lett，2002，332（2）：83－86.