rd10 小鼠視網膜組織結構和功能變化

郭從容 馬景學 張斌 崔月先

視網膜色素變性(RP)是一組以光感受器細胞和色素上皮細胞功能喪失為共同表現的遺傳性視網膜疾病。其主要表現為夜盲和進行性視野損害，最終因光感受器細胞變性死亡而導致中心視力喪失［1］。RP是由一系列廣泛的惡性基因突變所引發的病變，截至目前，已被發現的相關突變超過192種之多［2］。從基因突變到光感受器細胞變性死亡的發病機制尚不明確。目前在人類RP的某些類型中已經發現了和rd小鼠相同的基因突變位點［3］。目前rd1小鼠作為研究RP的動物模型已被廣泛應用［4］。但因其發病早，進展迅速，而并非理想的動物模型。rd10小鼠生后18 d變性開始，其發病晚進展較緩慢作為研究常染色體隱性遺傳性視網膜色素變性的模型明顯優于rd1小鼠［5］。我們對rd10小鼠自然病程中視網膜組織結構和功能變化進行了分析，為進一步的研究提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6(B6)和 B6.CXB1-Pde6brd10/J(rd10)小鼠均購自美國Jackson實驗室。小鼠均在12 h光照(150 lux)/12 h黑暗循環下飼養。

1.2 視網膜電圖(ERG)檢查 B6和rd10小鼠18只，出生后17、25、32 d行ERG檢查。每組6只小鼠，檢查前暗適應過夜。腹腔注射氯胺酮(50 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)麻醉，用含0.4%托吡卡胺和0.5%苯福林鹽酸鹽的滴眼液充分散瞳。參照文獻［6］的方法，右眼行ERG檢查。記錄強度為30 cd-s/m2，3 ms閃光刺激產生的暗適應ERG波形。之后用30 cd-s/m2光明適應10 min后，記錄30 cd-s/m2閃光刺激下明適應ERG波形。用SCOPE 3 Version 3.8.2軟件測量暗適應ERG的a波和b波振幅及明適應ERG最大波峰值用于統計學分析。

1.3 光學相干斷層成像(OCT)檢查 右眼ERG檢查后左眼行OCT檢查。使用Heidelberg公司的SD-OCT，以視乳頭為中心放射狀(12線)掃描，并通過其自帶的分析軟件測量距視乳頭中心2 000 μm的24點的全層視網膜厚度，取平均值用于統計學分析。

1.4 組織學檢查 OCT檢查后，斷頸處死動物。立即摘出左眼球(每組6只眼球)，保留1～2 mm長的視神經，固定于4℃，4%多聚甲醛磷酸緩沖液中24 h。梯度乙醇脫水，石蠟包埋，平行于角膜頂點至視盤的水平位做4 μm厚切片，行蘇木精-伊紅染色。測量兩側距視乳頭500 μm處視網膜外顆粒層(ONL)厚度，計數兩側距視乳頭500～740 μm范圍內ONL中細胞核的數量。取平均值進行統計學分析。

1.5 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OCT結果 用OCT檢查測量小鼠活體視網膜全層厚度。B6小鼠生后17 d時視網膜全層厚度已達(256±15)μm，且日齡增長厚度無明顯變化。rd10小鼠生后17 d時視網膜全層厚度達(253±15)μm，與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。但生后25 d時迅速減少到(166±6)μm，并隨日齡增長繼續變薄，至生后32 d時，視網膜組織只有(148±4)μm厚。見圖1。

圖1 OCT圖形及結果分析

2.2 組織學分析 組織學結果顯示，B6小鼠生后17 d時ONL厚度已達(53.4±4.2)μm，且日齡增長厚度無明顯變化。rd10小鼠生后17 d時 ONL厚度達(53.0±6.0)μm，與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。但生后25 d迅速減少到(23.7 ±4.0)μm，并隨日齡增長繼續變薄，至生后 32 d 時，ONL只有(9.0±1.6)μm厚。ONL中細胞核的數量也是同樣變化規律。見圖2。

圖2 組織學分析

2.3 ERG結果 無論是暗適應ERG還是明適應ERG的振幅，rd10小鼠組都明顯低于對照組(P＜0.05)。暗適應ERG a波，B6小鼠生后17 d時振幅已達(505±60)μV，并隨日齡增加略有加大。而rd10小鼠生后17 d時振幅只有(306±30)μV，并隨日齡增長振幅進一步降低。暗適應ERG b波，B6小鼠生后17 d時振幅已達(798±68)μV，并隨日齡增加略有加大。而rd10小鼠生后17 d時振幅只有(422±48)μV，并隨日齡增長振幅進一步降低。至日齡32 d時暗適應ERG幾乎接近于直線。明適應ERG最大波峰值，B6小鼠生后17 d時振幅已達(128±16)μV，并隨日齡增加略有加大。而rd10小鼠生后17 d時振幅為(110±12)μV，并隨日齡增長振幅進一步降低，生后25 d為(70±9)μV，生后32 d為(40±8)μV。見圖3。

圖3 ERG圖形及結果分析

3 討論

OCT檢查是一種新的影像學檢查方法，具有非創傷性、非接觸性的優點，并可進行微米級的定量分析，現已廣泛應用于臨床。OCT檢查是一種活體檢查，可動態觀察病變的變化，特別是某種治療方法療效的長期觀察，可大大減少實驗動物的使用量。

RP是遺傳性視覺損害和盲目的常見原因之一，世界各國的發病率為1/5 000～1/3 000，據估計全世界約150萬人患此疾病［7］。基于基因水平的藥物治療以及基因替代療法已被廣泛研究。但隨著研究的深入，越來越多的相關突變基因被發現，這一事實要求對其的治療進行更多的改進。然而這些改進都需要在動物模型上進行測試。測試效果取決于所采用的模型，而這些模型發生病變的速度要么太快，要么又太慢。以被廣泛應用的rd1小鼠模型為例，早在生后5～14 d，就產生了PDE6b基因突變的導致的嚴重后果，以至于視網膜在完全成熟之前，就已經損失了多層光感受器細胞［8］。rd10小鼠生后17 d無論是視網膜全層厚度還是ONL厚度都達到正常對照小鼠的厚度。雖然視網膜功能方面未能達到正常水平，我們最近的研究顯示完全黑暗環境下飼養rd10小鼠，可以使視網膜變性開始的時間延后和變性速度延緩。rd10小鼠的這種特性使得其更能模擬RP的發病過程。

我們的研究數據顯示，作為RP的動物模型rd10小鼠明顯優于rd1小鼠。特別是在早期治療的測試中rd10小鼠模型有更大的應用價值。

1 Hartong DT，Berson EL，Dryja TP.Retinitis pigmentosa.Lancet，2006，368:1795-1809.

2 程亞穎，趙秀勉，宮麗芬.不同濃度大鼠吸氧對新生大鼠視網膜影響的研究.河北醫藥，2011，33:3698-3700.

3 Bowes C，Li T，Danciger M，et al.Retinal degeneration in the rd mouse is caused by a defect in the beta subunit of rod cGMP-phosphodiesterase.Nature，1990，347:677-680.

4 Punzo C，Cepko C.Cellular responses to photoreceptor death in the rd1 mouse model of retinal degeneration.Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48:849-857.

5 Chang B，Hawes NL，Pardue MT，et al.Two mouse retinal degenerations caused by missense mutations in the beta-subunit of rod cGMP phosphodiesterase gene.Vision Res，2007，47:624-633.

6 Takahashi M，Miyoshi H，Verma IM，et al.Rescue from photoreceptor degeneration in the rd mouse by human immunodeficiency virus vector-mediated gene transfer.J Virol，1999，73:7812-7816.

7 Yao J，Jia L，Khan N，Zheng QD，et al.Caspase inhibition with XIAP as an adjunct to AAV vector gene-replacement therapy:improving efficacy and prolonging the treatment window.PLoS One，2012，7:e37197.

8 Souied EH，Reid SN，Piri NI，et al.Non-invasive gene transfer by iontophoresis for therapy of an inherited retinal degeneration.Exp Eye Res，2008，87:168-175.