益骨口服液對去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥血瘀病機微觀分子的影響

朱胤晟 姚新苗 呂一

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江 杭州 310005）

骨質(zhì)疏松是以骨量丟失，骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化為特征，以致骨的脆性增加及骨折危險性增加的一種全身性骨骼疾病[1]。前期實驗我們已證實益骨口服液能促進成骨細胞（OB）的增殖。中醫(yī)認為“腎虛”與“血瘀”是骨質(zhì)疏松癥的主要病機，因此設(shè)計本實驗從血瘀的角度，通過對血漿內(nèi)皮素（ET）、血小板膜糖蛋白CD62p、CD63指標的觀察，研究益骨口服液對骨質(zhì)疏松癥模型大鼠血瘀病理狀態(tài)的干預(yù)作用，觀察補腎活血方益骨口服液在補腎益骨的基礎(chǔ)上還可能具有的活血化瘀功效。

1 實驗材料與方法

1.1 藥物和器材 益骨口服液（由補骨脂10g，骨碎補15g，生地 15g，仙靈脾 15g，淮山藥 15g，丹參 30g組成），制成濃縮水提液，含生藥量1.0g/mL，用于大鼠灌胃治療，由浙江省中醫(yī)院中藥房提供。氯氨酮，上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號滬衛(wèi)藥準字（1995）第 001064號。大鼠內(nèi)皮素（ET-1）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，美國R&D公司生產(chǎn)。試劑單抗CD62p-PE、CD63-FITC，由Biopool生物有限公司提供。ELITE型流式細胞儀：采用美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)。密蓋息：瑞士諾華制藥有限公司，注冊證號：H20090459。

1.2 實驗動物 5月齡雌性SD大鼠80只，體重（200±10）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（滬）20080016，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。飼養(yǎng)室保持良好通風(fēng)，控制室溫在（21±1）℃，濕度 63%，噪音＜55 分貝，光照與黑暗時間為每12h交替。

1.3 造模 以氯胺酮按0.1g/kg腹腔麻醉后，行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。術(shù)后3d肌注青霉素4×10U，預(yù)防感染。

1.4 給藥 造模術(shù)后將SD大鼠以常規(guī)飼料喂養(yǎng)12周，第13周起開始每日給藥。益骨口服液組予益骨口服液10mL/kg，含生藥量1.0g/mL，每日2次灌胃；密蓋息組予密蓋息1.04U/kg肌肉注射，每周治療2次；益骨口服液+密鈣息組，用量用法同上2組；生理鹽水對照組予生理鹽水10mL/kg，每日2次灌胃。各組均給藥90d。

1.5 觀察指標

1.5.1 血漿內(nèi)皮素含量測定 采用酶聯(lián)免疫法測定，在末次給藥后禁食12h，從腹主動脈取血，注入含10%EDTA二鈉30μL和抑肽酶 20μL的試管中， 混勻，4℃，300r/min離心10min，分離血漿，置于-20℃保存，分批測定。

1.5.2 血小板膜糖蛋白CD62p、CD63含量測定 采用單克隆抗體流式細胞術(shù)檢測。具體方法如下：取血，抗凝，800r/min離心5min，取上層富含血小板的血漿（PRP），3500r/min離心15min，棄上清，加入 PBS 2mL，3000r/min 離心 10min，洗滌 2次，用1%多聚甲醛1.5mL室溫固定30min。將固定后的血小板懸液2500r/min離心10min，棄上清，分別加入熒光標記的CD62p、CD63特異性抗體 2mL，置室溫 30min，2500r/min離心10min，棄上清，加入1mL PBS將血小板懸浮。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包分別對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

各組大鼠治療后血漿內(nèi)皮素，血小板膜糖蛋白CD62p、CD63的含量變化見表1。

表1 各組大鼠治療后血漿內(nèi)皮素、CD62p、CD63含量（） ng/L

表1 各組大鼠治療后血漿內(nèi)皮素、CD62p、CD63含量（） ng/L

注：與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與密蓋息組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；

3 討論

骨質(zhì)疏松癥可導(dǎo)致因骨的脆性增高而骨折，骨折不可避免地會損傷血竇，致骨內(nèi)瘀血。由于容積增加而使骨內(nèi)壓升高，導(dǎo)致骨痛。以往對骨質(zhì)疏松癥的治療以腎主骨為根本指導(dǎo)思想，對本病的認識也多停留在補腎這一單一層面上[2]。而現(xiàn)代認為骨質(zhì)疏松癥是在腎虛的基礎(chǔ)上導(dǎo)致血瘀，尤其重視了瘀血在骨質(zhì)疏松癥病因病機中的作用[3]。而血瘀證的本質(zhì)與微循環(huán)障礙密切相關(guān)，雖然目前國外文獻尚未報道關(guān)于血瘀的概念，也無法從血瘀來探討原發(fā)性骨質(zhì)疏松，但有很多文獻報道了對原發(fā)性骨質(zhì)疏松與微循環(huán)改變關(guān)聯(lián)的研究[4]，這些微觀改變與中醫(yī)學(xué)血瘀證分子生物學(xué)研究有極大的相關(guān)性。認為血瘀的形成與血液成分、血流狀態(tài)、血管壁等病理變化密切相關(guān)[5]。

中醫(yī)認為血的運行必須依賴氣的推動，氣虛無以推動血行必定成瘀，表明血瘀證除了與“血行”有關(guān)外，還與血液本身成分的改變有關(guān)。目前血小板活化因子是血瘀證血液成分改變的研究熱點[6]。近年研究認為，CD62p、CD63都是活化血小板膜糖蛋白，分別存在于靜息血小板的a-顆粒內(nèi)及溶酶體膜，當血小板被激活時，血小板內(nèi)顆粒與血小板膜整合，CD62p、CD63表達于血小板表面，是目前所知的反映血小板活化與釋放反應(yīng)最特異性的標志物。內(nèi)皮細胞的存在為維持血液的流動狀態(tài)所必需，它的損傷是血管病變的始動因子。近年發(fā)現(xiàn)的低分子ET，是具有細胞信使樣作用的生活活性物質(zhì)。通過實驗證實ET對微循環(huán)血管的功能和結(jié)構(gòu)，對血細胞的聚集和黏附都有顯著的影響，已被視為血瘀證嚴重程度的指標[7]。

本實驗結(jié)果顯示：在給藥90d后，與生理鹽水對照組比較，益骨口服液能降低去勢大鼠血漿血小板膜糖蛋白CD62p、CD63的水平，降低血漿內(nèi)皮素的含量。通過對血管內(nèi)皮細胞功能及血小板膜糖蛋白的檢測，從微觀分子生物學(xué)角度，說明補腎活血方益骨口服液能改變骨質(zhì)疏松“血瘀”病理狀態(tài)下的客觀性變化。

到目前為止，關(guān)于血瘀與骨質(zhì)疏松癥直接相關(guān)的系統(tǒng)研究很少，筆者認為，中醫(yī)藥復(fù)方研究防治骨質(zhì)疏松癥，應(yīng)綜合運用多靶點、多途徑的研究渠道[8]。本研究是以內(nèi)皮素和血小板膜化蛋白為突破點，從“血瘀”立論，豐富了“腎虛”致病理論，從“血瘀”的病理本質(zhì)出發(fā)，對以后更深入研究中醫(yī)補腎活血法治療骨質(zhì)疏松癥提供理論及實驗依據(jù)。

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