骨橋蛋白和CD44v6在口腔鱗狀細胞癌中的表達及其意義

張晉弘，許彥枝，張玲玲，劉月平，劉 健*

（1.河北醫科大學第一醫院口腔科，河北石家莊050031；2.河北醫科大學第四醫院口腔科，河北石家莊050011；3.河北醫科大學第四醫院病理科，河北石家莊050011）

·論 著·

骨橋蛋白和CD44v6在口腔鱗狀細胞癌中的表達及其意義

張晉弘1，許彥枝2，張玲玲3，劉月平3，劉 健2*

（1.河北醫科大學第一醫院口腔科，河北石家莊050031；2.河北醫科大學第四醫院口腔科，河北石家莊050011；3.河北醫科大學第四醫院病理科，河北石家莊050011）

目的 探討骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和黏附分子CD44拼構變異體6（homing cell adhesion molecule variant6，CD44v6）在口腔鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義。方法采用免疫組織化學鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法檢測OPN和CD44v6蛋白在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達，分析其表達與患者臨床病理學資料之間的關系。結果OPN和CD44v6在口腔鱗狀細胞癌中陽性表達率分別為64.3％、61.2％，均明顯高于在癌旁正常口腔黏膜中的表達（P＜0.01）。OPN和CD44v6組織分化Ⅲ級的陽性率明顯高于Ⅰ～Ⅱ級，淋巴結轉移組陽性率明顯高于淋巴結未轉移組，差異有統計學意義（P＜0.05），但與性別、年齡無關。結論OPN和CD44v6與口腔鱗狀細胞癌的分化程度和淋巴結轉移關系密切，在其進展過程中起著重要的作用；而OPN與CD44v6的關系有待進一步研究。

口腔腫瘤；骨橋蛋白質；免疫組織化學

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部惡性腫瘤中最常見病理學類型，5年生存率約為50％，其浸潤和轉移是影響預后的主要因素，因而早期發現、預防腫瘤的轉移和復發是改善患者預后的重要因素。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種分泌型鈣結合磷酸化糖蛋白，首先發現于骨基質中。近年來，OPN與腫瘤發生發展的關系日益受到關注。OPN通過特有的與細胞黏附相關的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列與其受體整合素、CD44等結合來促進細胞的趨化、黏附、遷移和增殖，從而介導腫瘤細胞的侵襲轉移［1］。目前研究［2］顯示，細胞黏附分子CD44的表達與人類多種癌癥的轉移有關，其中其變體CD44v6與惡性腫瘤轉移的關系最為密切。本研究采用免疫組織化學SP法檢測OSCC中OPN及CD44v6蛋白的表達情況，探討其與病理特征之間的關系，旨在為判斷預后、指導臨床治療及預防患者復發提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取河北醫科大學第四醫院病理科2005年1月—2010年12月手術切除的原發性OSCC中性福爾馬林固定石蠟包埋組織98例。所有患者術前均未接受過放化療。其中男性51例，女性47例，年齡34～76歲，平均59.18歲；組織分化Ⅰ～Ⅱ級24例，Ⅲ級74例；淋巴結轉移57例，無轉移41例。選取30例癌旁組織（證實2cm外無腫瘤）及非腫瘤患者的正常組織。蠟塊4μm連續切片，其中一張切片常規HE染色，其余切片用于免疫組織化學染色。

1.2 免疫組織化學檢測：主要試劑包括OPN單克隆抗體（鼠抗人，AKm2A1）為美國Santa Cruz公司開發產品；CD44v6單克隆抗體（鼠抗人，VEF-7）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。采用SP免疫組織化學染色法常規10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續4μm厚切片。經二甲苯和梯度乙醇脫蠟、水化，高壓煮沸修復抗原；滴加一抗，置于4℃冰箱過夜；依次滴加生物素化山羊抗小鼠IgG及試劑，DAB顯色；蘇木素復染后水洗，依次酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，最后顯微鏡下觀察。分別用1.5％正常兔血清和0.01mol/L PBS液取代第一抗體作為替代對照和空白對照，用已知陽性片為陽性對照。

1.3 結果判定：陽性結果判斷標準為，光鏡下觀察、綜合分析整張切片陽性細胞所占的比例和染色強度。OPN蛋白的陽性定位在胞漿，陽性表現為瘤細胞胞漿內出現清晰可見的、定位準確的淡黃色至棕黃色顆粒。CD44v6的陽性定位在胞膜，陽性表現為瘤細胞胞膜出現清晰可見的、定位準確的淡黃色至棕黃色顆粒。

以染色強度和陽性細胞率的得分之和進行綜合評價，無染色為0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細胞占腫瘤細胞的百分比為陽性細胞率，陽性細胞率≤5％記0分，＞5％～25％記1分，＞25％～50％記2分，＞50％記3分。將上述2項積分相加，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中等強度陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。按照OPN及CD44v6蛋白表達程度為陽性組（++～+++）和陰性組（-～+）。

1.4 統計學方法：應用SPSS13.0軟件包進行數據處理，計數資料以百分率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CD44v6和OPN在OSCC及正常組織中的表達：98例OSCC中OPN的陽性率為64.3％，顯著高于在癌旁及正常組織中表達的16.7％，CD44v6的陽性率為61.2％，顯著高于在癌旁及正常組織中的表達10.0％，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表1，圖1～3。

2.2 CD44v6和OPN表達與臨床病理學資料的關系：CD44v6和OPN在組織分化Ⅲ級的陽性率明顯高于Ⅰ～Ⅱ級，淋巴結轉移組陽性率明顯高于淋巴結未轉移組，差異均有統計學意義（P＜0.05），但與性別、年齡無關。見表2。

表1 CD44v6、OPN在OSCC及正常組織中的表達Table1 CD44v6 and OPN expression in OSCC and pericancerous tissues （n）

表2 CD44v6、OPN在OSCC中的表達及其與臨床病理資料的關系Table 2 Relationship between the expression of CD44v6，OPN and the clinicopathological factors in OSCC （n）

3 討 論

人類OPN基因位于染色體4 q21～q25，包括7個外顯子和314個氨基酸殘基，其中含有如鈣結合域、凝血酶裂解位點及整合素RGD結合序列等多個功能結合區，在細胞的黏附與遷移、組織修復、細胞的信號轉導中發揮重要的作用［3］。最初的研究主要集中在骨骼和腎臟疾病中。隨著研究深入，人們發現OPN與腫瘤的關系很密切，在結腸癌［4］、卵巢癌［5］及頭頸部腫瘤［6］等原發腫瘤及其轉移瘤組織中高表達，并且在膀胱癌的研究中發現血清和組織OPN高表達的患者復發率呈增高趨勢，表明OPN可能在腫瘤發生及侵襲轉移中具有重要作用［7］。

CD44是通過細胞表面的跨膜糖蛋白介導細胞黏附作用，其中含有外顯因子v6的CD44變異體（CD44v6）與腫瘤的關系較密切［8］，且有學者認為其陽性表達率與OSCC轉移能力呈正相關關系［9］。

本研究結果顯示，組織分化越差OPN及CD44v6表達越高，淋巴結轉移組陽性率也明顯高于無淋巴結轉移組（P＜0.05）。提示OPN及CD44v6可能參與OSCC的侵襲和轉移。

Duterme等［10］認為在許多細胞如成纖維細胞和巨噬細胞等細胞外膜，胞內OPN與CD44、ERM（ezrin/radixin/moesin）蛋白形成復合體。Rao等［11］研究顯示OPN和CD44v6表達呈一致性，這與本研究結果相似，CD44v6表達可能隨OPN表達增加而上調。推測OPN可能通過與受體CD44v6結合來促進細胞的趨化、黏附和遷移而介導腫瘤細胞的遷徙轉移，在惡性腫瘤的轉移和復發中發揮重要作用。因此，臨床上有望通過聯合檢測OPN和CD44v6表達預測OSCC患者的預后，為OSCC患者的預后判斷和臨床治療提供理論依據。（本文圖見封二）

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（本文編輯：劉斯靜）

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF OSTEOPONTIN AND CD44v6 IN ORAL SQUAMOUSCELL CARCINOMA

ZHANG Jinhong1，XU Yanzhi2，ZHANG Lingling3，LIU Yueping3，LIU Jian2*（1.Department of Stomatology，the First Hospital of HebeiMedical University，Hebei Province，Shijiazhuang 050031，China；2.Department of Stomatology，Hebei Province Shijiazhuang 050011，China；3.Department of
Pathology，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Hebei Province Shijiazhuang 050011，China）

Objective To investigate the expression of osteopontin（OPN）and CD44v6 and their relationship with clinical pathological characteristics in oral squamous cell carcinoma（OSCC）.MethodsThe expression of OPN and CD44v6 proteins in oral squamous cell carcinoma were detected by SP immunohistochemical method.According to the clinical information，all data were analyzed by SPSS13.0 for windows to explore the relationship between the two indexes and the pathological features.ResultsThe positive rates of OPN and CD44v6 in oral squamous cell carcinoma were respectively 64.3％and 61.2％，which were significantly higher compared with those of adjacent non-tumor tissues and normal oralmembrane tissues（P＜0.01）.The positive rate expression of OPN and CD44v6 of poor differentiation group were significantly higher than those of well differentiation group and moderation differentiation group（P＜0.05）.The metastasis of lymph node，the expression levels of OPN and CD44v6 in lymph nodemetastasis group were significantly higher than those of non lymph nodemetastasis group（P＜0.05），however，no significant difference existed in gender and age.ConclusionThe

mouth neoplasms；osteopontin；immunohistochemistry

R739.8

A

1007-3205（2013）07-0745-04

2013-04-01；

2013-05-08

河北省衛生廳科研基金項目（20100281）

張晉弘（1975-），男，河北石家莊人，河北醫科大學第一醫院主治醫師，醫學碩士，從事口腔頜面外科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：zjh888fff@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.07.001

expression of OPN and CD44v6 are closely related with the differentiation degree，lymphatic node metastasis of oral squamous cell carcinoma，and they play important roles in the development of oral squamous cell carcinoma，and the relationship between OPN and CD44v6 gen needs further studies.