美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的含量測定

黃 麗，楊永壽，李夸巧，楊興彪，肖培云

（大理學(xué)院云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

美洲大蠊（Periplaneta americana）為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱“蟑螂”，首見于《本草綱目拾遺》，也稱其為石姜、滑蟲、偷油婆，茶婆子，灶螞子等。其入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》〔1〕，近幾年來，隨著我國對(duì)傳統(tǒng)中醫(yī)藥資源研究開發(fā)的重視，目前以美洲大蠊為原料的多個(gè)產(chǎn)品相繼研發(fā)成功，如“康復(fù)新滴劑”〔2〕、“心脈龍注射液”〔3〕、“肝龍膠囊”〔4〕等系列新藥。

文獻(xiàn)報(bào)道，美洲大蠊中含有大量的氨基葡萄糖類化合物〔5〕，氨基葡萄糖是葡萄糖的一個(gè)羥基被一個(gè)氨基取代的化合物，俗稱氨基糖，氨基葡萄糖分為硫酸氨基葡萄糖（如硫酸軟骨素）和鹽酸氨基葡萄糖兩種。氨基葡萄糖最重要的用途是構(gòu)成軟骨蛋白多糖的主要成分之一。硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，ChS）是一種天然酸性黏多糖，由D－葡萄糖醛酸和N－乙酰－D－氨基半乳糖以1，3－糖苷鍵結(jié)合的雙糖為基本單位聚合而成〔6〕，它屬于氨基葡萄糖類化合物，具有多種生物活性，有抗病毒、抗腫瘤、抗凝血、降血脂及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能〔7-12〕等重要生物活性，目前已得到了廣泛的重視和研究，并已應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和保健食品等行業(yè)〔13〕。有文獻(xiàn)〔14〕報(bào)道硫酸軟骨素的含量測定可用AHMT（4-氨基-3-肼基-5-巰基-1，2，4-三唑）法，其原理為AHMT與己糖醛酸或硫酸軟骨素，在氧化劑KIO4的堿性溶液中，AHMT與ChS生成紫色的衍生物，在540 nm波長處通過測定該衍生物的吸光度來測定ChS的含量，根據(jù)此原理，可用AHMT法來測定美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的含量，為美洲大蠊的進(jìn)一步研究提供檢測方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 紫外-可見分光光度計(jì)（TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），電子恒溫水浴箱（DZKW-4，上海科析試驗(yàn)儀器廠），電子分析天平（AL204-IC，梅特勒-托利多儀器上海有限公司），傅立葉紅外光譜儀（Nicolet 380FT-IR，美國Nicolet儀器公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-3000A，上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥 美洲大蠊藥材采自云南省大理州彌渡縣5家不同的養(yǎng)殖場，分別編號(hào)為：20120827、20120302、20120415、20120727、20121126，硫酸軟骨素對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：140792-201001），AHMT（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司），其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取硫酸軟骨素對(duì)照品250 mg，置50 mL量瓶中，加1 mol/L的KOH溶解，定容，搖勻，即得5 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取約0.5 g脫脂后的美洲大蠊粉末，置50 mL的比色管中，加入4 mol/L的NaOH溶液17.5 mL，于40℃的水浴鍋中溫浸1 h，取出，冷卻，定容至25 mL，過濾，精密移取續(xù)濾液10 mL，加入1%（g/mL）的活性炭脫色，過濾，即得供試品溶液。

2.1.3 AHMT溶液的配制 稱取0.50 gAHMT，加0.5 mol/L的HCl溶液溶解，于100 mL量瓶中定容，即得濃度為5 g/L的AHMT溶液。

2.1.4 KIO4溶液的配制 稱取1.00 gKIO4，加0.2 mol/L的KOH溶液溶解，于100 mL量瓶中定容，即得濃度為10 g/L的KIO4溶液。

2.2 吸收波長的選擇 分別精密移取“2.1.1”、“2.1.2”項(xiàng)下的對(duì)照品、供試品溶液各0.5 mL，分置10 mL量瓶中，加2 mol/L的KOH溶液3 mL，再加5 g/L的AHMT溶液3 mL〔13〕，密塞，混勻，置90 ℃水浴鍋中加熱25 min，取出，冷卻，加10 g/L的KIO4溶液1 mL，定容至刻度，搖勻，以顯色后的4 mol/L NaOH溶液作空白，在400～800 nm波長下掃描，得吸收光譜曲線。結(jié)果表明，對(duì)照品和供試品溶液在540 nm處均有最大吸收。見圖1。

2.3 對(duì)照品和供試品的紅外光譜比較 取“2.1.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液，冷凍干燥，得美洲大蠊氨基葡萄糖提取物。分別取一定量的對(duì)照品和提取得到的供試品，在相同條件下進(jìn)行紅外光譜檢測。結(jié)果表明，供試品與對(duì)照品具有相似的紅外吸收光譜。見圖2。

圖1 對(duì)照品和供試品的紫外吸收光譜圖

圖2 對(duì)照品和供試品的紅外吸收光譜圖

2.4 提取條件考察 本試驗(yàn)對(duì)NaOH溶液的濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度和顯色時(shí)間5個(gè)因素進(jìn)行考察。

2.4.1 NaOH溶液濃度考察 精密稱取約0.5 g脫脂后的美洲大蠊粉末，置50 mL的比色管中，按料液比為1∶35加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、

4.5 mol/L的NaOH溶液后，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下的方法顯色，以顯色后的4 mol/L NaOH溶液作空白，在540 nm波長處用1 cm比色皿測定溶液吸光度，結(jié)果表明，當(dāng)NaOH溶液的濃度為4 mol/L時(shí)，美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的含量最高。

2.4.2 料液比考察 精密稱取約0.5 g脫脂后的美洲大蠊粉末，置50 mL的比色管中，按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45比例加入4 mol/L的NaOH溶液后，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法處理，結(jié)果表明，當(dāng)料液比為1∶35時(shí)，測得美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的含量最高。

2.4.3 提取時(shí)間考察 精密稱取約0.5 g脫脂后的美洲大蠊粉末，置50 mL的比色管中，按1∶35比例加入4 mol/L NaOH溶液，在40 ℃下提取0.5、1、2、3、4、5、6、7 h后，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法處理，結(jié)果表明，當(dāng)提取時(shí)間為1 h時(shí)，美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的含量達(dá)到最大值，所以選擇提取時(shí)間為1 h。

2.4.4 提取溫度考察 精密稱取約0.5 g脫脂后的美洲大蠊粉末，置50 mL的比色管中，按1∶35比例加入4 mol/L NaOH溶液，分別在30、40、50、60、70 ℃下溫浸1 h后，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法處理，結(jié)果表明，當(dāng)提取溫度為40℃時(shí)，美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的含量最高。

2.4.5 顯色時(shí)間考察 精密移取“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0.5 mL（n=7），分別置10 mL量瓶中，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法處理，結(jié)果表明，當(dāng)顯色時(shí)間為25 min時(shí)，吸光度值最大。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密移取“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0.05、0.15、0.25、0.40、0.65、0.75 mL，分別置10 mL量瓶中，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法處理，以吸光度A為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液的濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=1.9914C+0.0114，r=0.9998，結(jié)果表明硫酸軟骨素在0.025～0.375 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密移取“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0.5 mL，置10 mL的量瓶中，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法處理，連續(xù)測定6次，記錄吸光度值，計(jì)算RSD值，RSD為0.15%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取“2.1.2”項(xiàng)下的供試品溶液0.5 mL，置10 mL的量瓶中，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法處理，間隔30 min測定1次吸光度，連續(xù)考察4 h，RSD值為1.92%，結(jié)果表明供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取約0.5 g脫脂后的美洲大蠊粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下的方法顯色，以顯色后的4 mol/L NaOH溶液作空白，于540 nm處測定吸光度。結(jié)果表明，美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的平均含量為180.35 mg/g，RSD為3.11%（n=5）。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的美洲大蠊粉末（已脫脂）約0.3 g，分別加入7 mL“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下的方法顯色，以顯色后的4 mol/L NaOH溶液作空白，于540 nm處測定吸光度，計(jì)算美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的平均回收率。見表1。2.6 供試品測定 分別精密稱取批號(hào)為20090827、20100302、20100415、20110727、20121126 的 樣 品 ，每個(gè)批號(hào)3份，每份約0.5 g，按“2.4”項(xiàng)下考察得到的最佳條件制備供試品溶液，按最佳顯色條件測定。見表2。

表1 美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的回收率測定（n=6）

3 討論

硫酸軟骨素的含量測定方法有比色法〔15〕、咔唑比色法〔16〕、間苯三酚法〔17〕、AHMT法〔14〕等，但比色法和咔唑法操作繁瑣、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度較差，所以目前主要采用AHMT法，該法操作簡便、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性好、回收率高。硫酸軟骨素屬于氨基葡萄糖類化合物，所以也可用AHMT法來測定美洲大蠊中氨基葡萄糖類化合物的含量。

由單因素考察可得，提高NaOH溶液的濃度有助于黏多糖的提取，但隨著NaOH濃度的提高，提取液顏色略加深，同時(shí)有異味出現(xiàn)，這是由于在濃堿作用下，部分蛋白的糖肽鍵斷裂，并釋放出單糖分子，處于糖鏈還原端的糖基在堿性條件下，逐漸生成間糖酸和異糖酸而脫落，脫落的糖類物質(zhì)發(fā)生副反應(yīng)，產(chǎn)生顏色和異味，同時(shí)黏多糖分子量變小〔18〕。

表2 供試品測定結(jié)果（n=5）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，美洲大蠊藥材中氨基葡萄糖類化合物的含量存在較大差異，不同批次的藥材中氨基葡萄糖類化合物的含量不同，這可能與美洲大蠊藥材的喂養(yǎng)飼料、生長環(huán)境、養(yǎng)殖時(shí)間不同有關(guān)，因此必須進(jìn)行美洲大蠊藥材的規(guī)范化養(yǎng)殖（GAP）研究，制定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），最終實(shí)現(xiàn)美洲大蠊藥材的規(guī)范化養(yǎng)殖。

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