羊肚菌分子分類及人工培養研究現狀

才曉玲，何 偉，安福全，于龍鳳*

（1.臨滄師范高等專科學校，云南臨滄 677000；2.臨滄市第三中學，云南臨滄 677000）

羊肚菌分子分類及人工培養研究現狀

才曉玲1，何 偉2，安福全1，于龍鳳1*

（1.臨滄師范高等專科學校，云南臨滄 677000；2.臨滄市第三中學，云南臨滄 677000）

對羊肚菌的分子分類研究及人工培養等方面進行了綜述，旨在為羊肚菌的深入開發利用提供一定的方向和依據。

羊肚菌；分子分類；人工培養

羊肚菌，又稱美味羊肚菌，別名羊肚菜、羊肚蘑、地羊肚子、木耳蘑菇、編笠菌、陽雀菌、蜂窩落等，因其菌蓋表面生有許多小凹坑，外觀極似羊肚而得名，它是一種野生名貴食（藥）用真菌之一，有“食用菌皇后”之美譽〔1-4〕。多年來，僅美國Garry Mill初步實現了羊肚菌的工廠化栽培，并被美國DNP公司獨家購買應用。在國內，朱斗錫對羊肚菌的工廠化栽培試驗雖已進行多年，但還未取得成功〔5〕。為了加快這一名貴食（藥）用菌的開發，筆者綜述了近年來國內外羊肚菌的研究現狀。

1 分子水平分類研究

羊肚菌屬（Morchella Dill.ex Pers.），于1794建立〔6〕，隸屬于子囊菌亞門（Ascomycotina）盤菌綱（Discomycetes） 盤菌目 （Pezizales） 羊肚菌科（Morchellacea）〔2〕。羊肚菌屬是世界上著名的大型真菌之一，分布廣泛，根據Boudier分類系統，羊肚菌分為4組（真生組、開裂組、假真生組和紙質組），2亞組（肉質亞組、半肉質亞組），3族（高族、圓族和普通族）。Guzman＆Tapia認為根據羊肚菌屬的總體形態可將其分為3個類群：黑羊肚菌、黃羊肚菌和半開羊肚菌〔7〕。當前國際上公認的羊肚菌科下分3屬，分別為羊肚菌屬（Morchella）、鐘菌屬（Verpa）、皺盤菌屬（Disciotis）〔8〕。據 Emile Jacguetant在《LeMorilles》一書中報道，羊肚菌屬共有28個種，目前，世界上羊肚菌有效記錄物種單元為217個（包括亞種和變種）〔9〕，已經發表的羊肚菌屬有33個種（包括亞種和變種），主要分布于亞洲、歐洲、北美洲及大洋洲等地區〔10〕。

在我國，羊肚菌最早收錄于李時珍的《本草綱目》〔11〕。鄧叔群在《中國的真菌》中記載了5種，中國菌物學家戴芳瀾報道了8種〔12〕。至今，中國已報道羊肚菌屬真菌達22種〔13-16〕，在這22種內，有研究者認為小羊肚菌（M.deliciosa）、美味羊肚菌（M. esculenta）與粗柄羊肚菌（M.crassipes）可能分別屬于同一生物學種的早、中、晚3個發育階段；黑脈羊肚菌（M.angusticeps）、尖頂羊肚菌（M.conica）與高羊肚菌（M.elata）也可能分別屬于同一生物學種的早、中、晚3個發育階段〔17〕。Volk和Leonard根據菌絲融合試驗認為小羊肚菌、美味羊肚菌和粗柄羊肚菌在遺傳上應該存在密切關系；Gessner、Yoon也支持Volk等的觀點〔18-20〕。當前，人們利用同工酶、全序列PCR/RFLP、RAPD的分析認為，羊肚菌屬真菌在其形態分類種的基礎上可能進一步劃分為4個大的分類群：黃色羊肚菌群（Yellow morel）、黑色羊肚菌群（Black morel）、半開羊肚菌群（Half morel）和紅褐色羊肚菌群（Red-brownblushing morel）〔21-23〕。但劉文叢等〔24〕應用ISSR分子標記法對滇西北地區56種羊肚菌遺傳多樣性分析，認為中國已有記錄的眾多羊肚菌種可以合并為2個復合種，聚類結果與地理距離有明顯的相關性。隨著分子生物學的發展，垂直板淀粉電泳酶分析〔25-26〕、rDNA ITS序列測定〔27-28〕、rDNA ITS的PCR-RFLPs分析〔29〕、IGS分析〔29〕和微衛星序列分析〔30〕等手段已在羊肚菌鑒定上得到使用。研究者通過同工酶分析認為小美味羊肚菌（M.deliciosa）的菌株應歸類到美味羊肚菌M. esculenta〔26〕，通過RAPD技術對羊肚菌居群的多樣性研究，可以較為真實地反映羊肚菌的遺傳特性，陳吉岳等運用RAPD分析把國內15個供試羊肚菌菌株完全區別開來〔31〕。但由于種內多樣性豐富，用RAPD技術對單一菌株進行研究會出現差異大而將同一種鑒定為不同種。研究者對北美羊肚菌的DNA研究，結果表明只有3種基本的羊肚菌類型，即黑色（black）、黃色（yellow）和半自由（half-free），許多被定為種的羊肚菌都被歸入3個真實的種，而且同一個種在地理學上的孤立群體有可能被明顯地分為2個不同的種〔28〕，Goldway等研究顯示來自以色列Dan Nature Reserve地區的尖頂羊肚菌M.conica DNA-PCR指紋圖譜與包括毗鄰地區在內的任何地區的該羊肚菌指紋圖譜都不同。此外，在熱帶和亞熱帶地區還有一個羊肚菌菌種變紅的分類群，包括紅褐羊肚菌（M.rufobrunnea）、危地馬拉羊肚菌（M. guatemalensis）和硬羊肚菌（M.regidoides）〔32〕。綜上所述，對于羊肚菌屬系統分類主要在類群的劃分及種的鑒定方面存在著分歧，對于羊肚菌種的鑒定還需要不斷地探索和研究。

2 人工培養

2.1 培養基質在實現食用菌人工培養的過程中，栽培基質的選擇是重要環節之一〔2〕。張松等〔33〕研究表明碳、氮源濃度和培養溫度、pH等是食用菌生長與代謝的重要條件。董雪等〔34〕研究發現菌株Me11和Me12均在25℃的酵母膏培養基中長勢最好，王廣耀等〔35〕篩選出以馬鈴薯、葡萄糖、玉米粉、豆餅等為主原料的最佳母種培養基，研究者分別以陜北羊肚菌M延-5（采自南泥灣山區）、羊肚菌Sn-l菌株（采自沈陽天柱山）、羊肚菌LWY-1（采自遼寧朝陽羊山村河套楊樹林）、羊肚菌M.E.194（采自新疆天山腳下葡萄園）、黑脈羊肚菌（M.angusticeps）為研究材料，發現羊肚菌菌絲生長的最佳碳源有可溶性淀粉〔36-42〕、葡萄糖〔43-46〕、蔗糖和白糖〔47〕，最適氮源是尿素〔36-38，43〕、天冬氨酸〔40〕、半胱氨酸和亞硝酸鈉〔40〕、硝酸鉀、硝酸鈉〔39，45〕、蛋白胨〔46，48〕、魚粉和豆粕粉〔47〕。不同來源的羊肚菌最佳碳、氮源不同，因為不同種（株）的羊肚菌對營養條件和環境條件的要求不同；即使同一菌株在不同的營養條件下，菌絲的形態、顏色等培養特征也不完全相同，這些差異反映了羊肚菌生理特性的多樣性。

2.2 液體深層發酵隨著人們對羊肚菌的需求日益擴大，野生羊肚菌已不能滿足市場的需求，由于羊肚菌菌絲體與子實體含有相同的營養成分〔49〕，這就使液體培養成為一個重要的研究方向。謝占玲等〔42〕認為最適合液體發酵的菌株為M.angusticeps，劉衛紅等〔50〕采用玉米粉、葡萄糖、黃豆粉等為培養基，發現生產液體羊肚菌菌種具有發菌快，菌齡一致的優點，可以實現快速規模化生產。也有研究〔51〕表明采用PDG培養基，其生物量明顯高于YGJ，加腐殖質酸（濃度1/700）對羊肚菌的生長具有刺激作用；研究〔52〕表明以PDA母種培養基，添加草木灰濃度為20 g/L時，尖頂羊肚菌菌絲及菌核在數量和質量上都最佳。歐超〔53〕認為羊肚菌液體深層發酵的最優培養基配比為：玉米粉4.0 g/dL、葡萄糖1.0 g/dL、黃豆粉2.0 g/dL、酵母粉0.3 g/dL、KH2PO40.2 g/dL、MgSO40.1 g/dL、CaSO40.1 g/dL；最優培養條件為：24℃，起始pH 5.8，250 mL的搖瓶裝液量為100 mL，接種量10 mL，搖瓶轉速140 r/min，發酵時間為108 h；也有研究〔54〕認為羊肚菌液體發酵適宜條件為：22℃、pH7.0、120 r/min，10%接種量，裝量100 mL/250 mL。羊肚菌（GIM 5.69）產生胞外多糖的最佳發酵條件為：蔗糖3.98%，培養時間5.98 d，轉速217.44 r/min〔55〕。此外，研究者〔56〕還發現羊肚菌（M延-5）發酵液的pH值的變化與菌絲體產量呈正比關系，可以把培養液pH值的變化作為培養過程中監測發酵終點的指標。

3 存在問題及展望

當前，關于羊肚菌種的劃分，盡管運用分子學生物手段做了大量的研究，但是依然存在一些問題，如在分類上，傳統形態學和分子生物學研究會得到相悖的結論，需要做更深入的研究。人們對羊肚菌生物學特性雖然有了一定的了解，但要實現羊肚菌大規模人工栽培及工廠化生產依然是真菌學家急需攻克的難題。人們對羊肚菌菌絲培養及液體發酵研究和利用已經有了一定的進展，尤其是近年來仿生栽培學的深入研究，研究者已經掌握了羊肚菌自然狀態下的生長因子，相信在不久的將來在中國一定也可以實現羊肚菌的商業化栽培。

〔1〕謝占玲，謝占青.羊肚菌研究綜述〔J〕.青海大學學報：自然科學版，2007，25（2）：36-40.

〔2〕李華，包海鷹，李玉.羊肚菌研究進展〔J〕.菌物研究，2004，2（4）：53-60.

〔3〕李燁，溫魯.羊肚菌的研究與開發〔J〕.中國食用菌，2004，23（1）：6-8.

〔4〕宗凱，杜光.食（藥）用羊肚菌研究現狀〔J〕.中國藥師，2006，9（5）：460-462.

〔5〕朱斗錫.羊肚菌工廠化栽培技術的探討〔J〕.浙江食用菌，2010，18（1）：43-44.

〔6〕Jacquetant E.Les Morilles，La Bibliotheque des Arts Paris〔M〕.1984.

〔7〕Guzmán G，Tapia F.The known morels in Mexico，a descriptionofanewblushingspecies.Morchellarufobrunnea，and new data on M.guatemalensis〔J〕.Mycologia，1998（90）：705-714.

〔8〕Alan H Hall，David G Spoerke，Barry H Rumack.Mushroom Poisoning：Identification，Diagnosis and Treatment〔J〕. Pediatrics in Review，1987（8）：291-298.

〔9〕CABI.Morchella〔DB/OL〕.〔2010-10-13〕.http：//www. indexfungorum.org/Names/Names.asp.

〔10〕卯曉嵐.中國大型真菌〔M〕.鄭州：河南科學技術出版社，2000：595-600.

〔11〕胡克興，董雪，范黎.羊肚菌屬分子系統學研究進展〔J〕.微生物學通報，2004，31（6）：115-119.

〔12〕鄧叔群.中國的真菌〔M〕.北京：科學出版社，1963.

〔13〕蘭進，曹文芩，徐錦堂.中國羊肚菌屬真菌資源〔J〕.資源科學，1999，21（2）：56-61.

〔14〕趙琪，徐中志，戚淑威，等.云南省松茸產業初步研究〔J〕.西南農業學報，2008，21（1）：226-229.

〔15〕Chen J Y，Liu P G.A new species of Morchella（Pezizales，Ascomycota）from southwestern China〔J〕.Mycotaxon，2005（93）：89-93.

〔16〕Li S H，Zhao Y C，Chai H M，et al.Two new species in the genus，Morchella，（Pezizales，Morchellaceae） from China〔J〕.Mycotaxon，2005（95）：319-322.

〔17〕Bunyard B A，Nicholson M S，Royse D J.Phylogenetic resolution of Morchella，Verpa，and Disciotis（Pezizales：Morchellaceae）based onrestriction enzyme analysis of the 28 S ribosomal RNA gene〔J〕.Experimental Mycology，1995（19）：223-233.

〔18〕Volk T，Leonard T.Physiological and environmental studies of sclerotium formation and maturation in isolates of Morchella crassipes〔J〕.Applied&Environmental Microbiology，1989（55）：3095-3100.

〔19〕Gessner R V，Romano M A，Schultz R W.Allelic variation and seg-regation in Morhcella deliciosa and M.esculenta〔J〕.Mycologia，1987（79）：683-687.

〔20〕Jung S W，GessnerR V，Keudell K C，et al.Systematics of Morchella esculenta complex using enzyme-linke immunosorbent assay〔J〕.Mycolohia，1993（85）：677-684.

〔21〕Kuo M.Morchella tomentosa，a new species from western NorthAmerica，andnotesonM.rufobrunnea〔J〕.Mycotaxon，2008（105）：441-446.

〔22〕Masaphy S，Zabari L，Goldberg D.New long season ecotype of Morchella rufobrunnea from Northern Israel〔J〕. Micologia Aplicada International，2009，21（2）：45-55.

〔23〕Pilz D，McLain R，Alexander S，et al.Ecology and management of morels harvested from the forests of Western North America.USD Ageneral technical report〔R〕.Portland，PNW-GTR-710，2007.

〔24〕劉文叢，張建博，桂明英，等.滇西北地區5種羊肚菌遺傳多樣性的ISSR分析〔J〕.中國食用菌，2011，30（4）：38-42.

〔25〕Royse D J May B.Interspecific Allozyme Variation among Morchella spp.and its Inferences for Systematics within the Genus〔J〕.Biochemical Systematics and Ecology，1990（18）：475-479.

〔26〕Yoon C S，Gessner R V，Romano M A.Population Genetics and Systematics of the‘Morchella esculenta’complex〔J〕. Mycologia，1990（82）：227-235.

〔27〕Wipf D，Munch J C，Botton B，et al.Dna Polymorphism in Morels：Complete Sequences of the Internal TranscribedSpacer of Genes Coding for rDNA in Morchella esculenta（YellowMorel）and Morchella Conica（BlackMorel）〔J〕. Applied&Environmental Microbiology，1996（62）：3541-3543.

〔28〕O Donnell K，Cigelnik E，Weber N S，et al.Phylogenetic relationships among ascomycetous truffles and the true and false morels inferred from 18S and 28S ribosomal DNA sequence analysi〔sJ〕.Mycologia，1997（89）：48-65.

〔29〕Wipf D，Fribourg A，Munch J C，et al.Diversity of the internal transcribed spacer of rDNA in morels〔J〕.Canadian Journal of Botany，1999（45）：769-778.

〔30〕Bunyard B，Nicholson M，Royse D.Phylogenetic resolution ofMorchella，Verpa，andDiscioti〔sPezizales：Morchellaceae〕based onrestriction enzyme analysis of the 28S ribosomal RNA gene〔J〕.Experimental Mycology，1995（19）：223-233.

〔31〕陳吉岳，劉培貴.國產羊肚菌菌株的RAPD鑒別〔J〕.云南植物研究，2004，26（4）：434-438.

〔32〕Goldway M.Morchella conica exhibiting a long fruiting season〔J〕.Mycological Research，2000（104）：1000-1004.

〔33〕張松，胡蝦妹，謝海燕.尖頂羊肚菌液體培養基質與條件的研究〔J〕.菌物研究，2004，2（4）：11-15.

〔34〕董雪，王玉婕，周萍.羊肚菌菌株Me11和Me12的培養特性研究〔J〕.首都師范大學學報：自然科學版，2003，24（4）：51-54.

〔35〕王廣耀，蔣曉成，程 喆.羊肚菌菌種分離及母種培養基的篩選〔J〕.北方園藝，2009（9）：211-212.

〔36〕朱永真，杜雙田，車進，等.不同碳源及氮源對羊肚菌菌絲生長的影響〔J〕.西北農林科技大學學報：自然科學版，2011，39（3）：113-118.

〔37〕賀青提.尖頂羊肚菌液體培養產胞外多糖及其在動物體內生理效應的研究〔D〕.廣州：華南師范大學，2006.

〔38〕刁治民，鮑敏，祝鮮寧.羊肚菌菌絲營養生理特性的研究〔J〕.青海師范大學學報：自然科學版，2001（3）：62-66.

〔39〕董雪.黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps）生物學特性研究〔D〕.北京：首都師范大學，2004.

〔40〕劉士旺，劉文.不同碳氮源對尖頂羊肚菌（Morchella conica）生長的影響〔J〕.徐州師范大學學報：自然科學版，1998，16（3）：62-64.

〔41〕王生財.青海互助北山林場羊肚菌生物學特性及人工馴化的研究〔D〕.西寧：青海師范大學，2006.

〔42〕謝占玲，何智媛，唐龍清，等.五株羊肚菌碳、氮源及適合發酵菌株的篩選〔J〕.食用菌學報，2009，16（1）：43-46.

〔43〕任桂梅，賀曉龍，路敏.羊肚菌M延-5菌株菌絲體生長所需碳氮源的研究〔J〕.安徽農業科學，2006，34（13）：2947-2948.

〔44〕趙春燕，孫軍德，李敏，等.培養條件對羊肚菌菌絲生長的影響〔J〕.中國食用菌，2005，24（1）：15-17.

〔45〕柴林山，李莉，冀寶贏，等.羊肚菌LWY-1生物學特性的研究〔J〕.食用菌，2010（1）：12-14.

〔46〕彭璐，常繼東.羊肚菌菌絲體培養特性的研究〔J〕.食用菌，2006（5）：10-12.

〔47〕楊芳，王新風，李剛，等.不同碳、氮源對羊肚菌生長與胞內多糖的影響〔J〕.食品科學，2007，28（11）：396-400.

〔48〕劉興蓉，陳芳草，譚方河，等.羊肚菌產核條件研究〔J〕.四川林業科技，2004，25（3）：43-47.

〔49〕尤正海.羊肚菌的研究及其應用開發前景〔J〕.中國生化藥物雜志，1997，18（3）：160-161.

〔50〕劉衛紅.羊肚菌液體菌種培養基配方優化研究〔J〕.農業科技通訊，2011（11）：81-83.

〔51〕李曉明，趙嘉平，唐周斌.羊肚菌液體發酵的研究〔J〕.西北林學院學報，2004，19（3）：116-118.

〔52〕侯志江，程遠輝，戚淑威，等.不同濃度草木灰對尖頂羊肚菌菌絲生長及菌核形成的影響〔J〕.西南農業學報，2011，24（5）：2020-2022.

〔53〕歐超，王娣，張兆軒，等.羊肚菌液體深層發酵條件〔J〕.食品與生物技術學報，2007，26（2）：80-86.

〔54〕白晨，王淑珍，陸文蔚.用于健康食品生產的羊肚菌發酵條件的研究〔J〕.食用菌，2010（1）：17-18.

〔55〕崔華麗，劉增武，方玉明，等.響應面法優化羊肚菌胞外多糖的發酵條件〔J〕.中藥材，2011，34（5）：782-786.

〔56〕曹娟云，任桂梅，張雪.羊肚菌液體培養菌絲體產量與培養液pH值的關系〔J〕.江蘇農業科學，2007（4）：176-177.

Present Situation on Molecular Taxonomy and Artificial Cultivation of Morchella

CAI Xiaoling1，HE Wei2，AN Fuquan1，YU Longfeng1*
（1.Lincang Teachers’College,Lincang，Yunnan 677000,China；2.No.3 Middle School of Lincang,Lincang，Yunnan 677000,China）

The research advance in Morchella,including molecular taxonomy and artificial cultivation is summarized in order to provide a basis for further development and utilization.

Morchella；molecular taxonomy；artificial cultivation

S646

A

1672-2345（2013）04-0044-04

臨滄師范高等專科學校自然科學、基礎應用研究基金資助項目（LCSZL2012009）

2012-08-28

2012-10-15

才曉玲，講師，主要從事土壤與植物營養研究.

（責任編輯 毛本勇）

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.04.012

*通信作者：于龍鳳，教授.