洱海水華銅綠微囊藻生長特性的初步研究

倪兆林，王 濤，張 玲，林麗佳，楊冠英，張 義，申元英*

（1.大理學院公共衛生學院，云南大理 671000；2.大理學院基礎醫學院，云南大理 671000）

洱海水華銅綠微囊藻生長特性的初步研究

倪兆林1，王 濤2，張 玲1，林麗佳1，楊冠英1，張 義2，申元英1*

（1.大理學院公共衛生學院，云南大理 671000；2.大理學院基礎醫學院，云南大理 671000）

目的：分離純化出洱海主要的優勢銅綠微囊藻并觀察其生長規律及特性。方法：采用水滴-涂布平板法分離純化銅綠微囊藻，采用90%的丙酮提取葉綠素，酶標儀測定其含量，用顯微鏡計數藻細胞的個數。結果：銅綠微囊藻細胞密度與OD665呈直線關系，R2=0.993 1，藻細胞的增長速率在第6天達到最大值為0.524，其葉綠素及類胡蘿卜素的含量隨時間的變化而逐步升高。結論：此銅綠微囊藻的生長符合“S”型曲線，藻細胞密度與吸光度成線性相關，其生長速率在第6天達到最大。

洱海；銅綠微囊藻；分離；生長曲線；葉綠素a

洱海位于云貴高原西部，大理白族自治州境內，全湖面積246 km2，平均水深10.5 m，容積27.7億m3，為云南省第二大淡水湖泊〔1〕，是大理州生態、經濟、社會發展的基礎條件〔2〕。近年來隨著社會經濟的發展，人類對洱海開發活動的不斷加劇，洱海現正處于中營養水平向富營養湖泊的過渡階段〔3〕，洱海藍藻水華自1996年9月在洱海首次大面積發生以來，每年夏秋季都會頻繁地在大部分湖灣發生〔4〕。盡管近兩年加大了對洱海的治理，但藍藻水華依然是困擾洱海可持續發展的重要問題。微囊藻水華是洱海常見的藍藻水華，其爆發嚴重影響了洱海多種功能的正常發揮。因此，研究洱海主要的微囊藻屬銅綠微囊藻的生長規律及其特征，為進一步有效地分離溶藻細菌以控制水華的發生具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 藻種及其分離純化藻種于2011年7月采自大理洱海微囊藻爆發期間，用高溫滅菌的毛細吸管吸取稀釋適度的藻液，滴到已消毒的載玻片上，藻液水滴盡可能小些，要求在顯徽鏡低倍鏡視野中能看到水滴的全部或大部。1片載玻片滴2～3滴，水滴直線排列，互相間隔一定距離。在顯微鏡下詳細觀察每一滴藻液〔5〕，如果一滴藻液內只有一個或幾個所需要分離的同種藻類細胞，無其他生物混雜，即用BG11培養液把這一滴藻液沖入BG11固體平板表面，涂布培養2～3 d，反復幾次后形態觀察確定為銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）單克隆藻株，即可挑取單藻株到BG11液體培養液中逐級擴大培養，用作實驗材料。

1.2 藻種的培養藻種在自然條件下采用藻類通用BG11培養基：1 000 mL去離子水中加入NaNO3：1.500 g；MgSO4·7H2O：0.075 g；Na2SiO3·9H2O：0.058 g；Ferric ammonium citrate：0.006 g；Na2CO3：0.020 g；K2HPO4：0.040g；CaCl2·2H2O：0.036g；Citricacid：0.006 g；EDTA：0.001 g；A5solution＋Co：0.001 g。

A5solution＋Co微量元素的配制：1 000 mL去離子水中加入H3BO3：2.860 g；ZnSO4·7H2O：0.222 g；Na2MoO4·2H2O：0.039 g；MnCl2·4H2O：1.810 g；CuSO4· 5H2O：0.079 g；Co（NO3）2·6H2O：0.049 g。

藻固體培養基為BG11液體培養基加1.5%的瓊脂。

1.3 銅綠微囊藻生長曲線的測定取上述分離好的銅綠微囊藻培養液接入100 mL三角瓶中，內裝50 mL藻培養液，自然條件下，每天固定時間搖床震蕩培養2 h并定時取樣測定665 nm處〔6〕的吸光度值，顯微鏡計數培養液中藻細胞的個數（n），以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制生長曲線。

1.4 銅綠微囊藻生物量的測定及日增長率的計算按照“1.3”的方法制備觀察藻液體，每天定時取樣測定665 nm處藻細胞懸浮液吸光度表示細胞生物量。依下式〔7〕計算日增長速率：

式中：μ為日增長率，Nt為藻類當天生物量，Nt-1為藻類前一天的生物量。

1.5 葉綠素a（Chla）、類胡蘿卜素（CAR）含量的測定取預培養5 d的銅綠微囊藻液，每天定時取樣（1 mL/次），4 500 r/min，離心10 min，棄去上清液，加入等體積90%（v/v）的丙酮，混合均勻，將混勻的液體放置在4℃黑暗條件下抽提24 h，然后再離心10min，取上清，用酶標儀分別測定在665nm、649nm、480 nm處的吸光度，計算其葉綠素a（μg/mL）、類胡蘿卜素（mg/mL）的含量，然后以時間為橫坐標，含量為縱坐標，繪制標準曲線。計算公式〔8-9〕分別為式

2 結果

2.1 銅綠微囊藻細胞密度與吸光度值的相關性由圖1可知藻細胞的密度與665 nm處的吸光度值呈直線關系，R2=0.993 1，在一定的范圍內，藻細胞的數量是隨著吸光值的增加而增加的。因此，通過對藻液吸光度值的測定，可知藻細胞的數量，同時也可通過測定藻溶液的光密度值來代表銅綠微囊藻的生長情況。

圖1 藻細胞密度與吸光度值得相關性標準曲線

2.2 銅綠微囊藻的生長曲線將預先饑餓培養的銅綠微囊藻稀釋后在自然條件下生長，測定其OD665值并繪制生長曲線如圖2所示，由圖中可以看出此株銅綠微囊藻的生長符合“S”型曲線，在生長的前4 d為生長調整期，增長較緩慢，4 d以后進入對數期，在第6天達到最大日增長速率為0.524，16 d以后進入衰亡期。

圖2 銅綠微囊藻的生長曲線

2.3 葉綠素a隨時間的變化曲線此株銅綠微囊藻在初始OD665為0.213，初始葉綠素a含量為0.435 μg/mL時的葉綠素a含量變化曲線如圖3所示，由圖可知此株銅綠微囊藻葉綠素a的含量隨時間的增加而增高，當微囊藻生長到第12天之后其葉綠素a的含量變化不明顯。

圖3 銅綠微囊藻的葉綠素a含量變化曲線

2.4 類胡蘿卜素的含量變化此株銅綠微囊藻在初始OD665為0.213時的類胡蘿卜素含量變化曲線如圖4所示，由圖可知在前8 d類胡蘿卜素含量呈對數變化，但隨后逐漸減慢。

圖4 銅綠微囊藻類胡羅卜素的含量變化曲線

3 討論

最常見洱海水華藍藻能形成群落的優勢種〔4〕有：銅綠微囊藻、螺旋魚腥藻（Anabaena spiroides）、水華束絲藻（Aphani jomenonflos-aquae）等，而銅綠微囊藻、螺旋魚腥藻是形成水華、影響水功能的重要物種。洱海藻類爆發的時間為11月至翌年3月，3～4月水華束絲藻成為洱海優勢種，4～7月微囊藻爆發，7～11月魚腥藻爆發，其演替方向是硅藻和綠藻—水華束絲藻—微囊藻—魚腥藻—硅藻和綠藻〔10〕，所以本研究于7月份采集的為微囊藻屬。結果表明銅綠微囊藻的生長符合“S”型曲線，有明顯的增長期、對數區、穩定區和衰亡期。實驗中通過研究其銅綠微囊藻的藻細胞密度與665 nm處的吸光度值的關系可知它們呈直線相關，藻細胞的數量隨著吸光度的增加而增加，這與牛丹丹的報道〔11〕相似，我們可以通過測定藻液吸光度值，推測藻細胞的數量，進而推測藻細胞的生長速度。

通過計算后發現此株銅綠微囊藻在第6天的增長速率達到最大為0.524，同時觀察此時的葉綠素a、類胡蘿卜素的含量變化和在665 nm處藻液的吸光度值發現，此時藻細胞正處于生長對數期接近穩定區，符合藻細胞的生長規律，以后藻細胞的增長逐漸減慢，而葉綠素及類胡蘿卜素的含量趨近平衡。可能的原因為營養物質用盡，藻毒素分泌太多造成這種情況，具體的原因正在研究。

〔1〕潘曉潔，常鋒毅，康麗娟，等.洱海魚腥藻優勢種的形態鑒定與16S rRNA基因序列分析〔J〕.武漢植物學研究，2008，26（3）：229-234.

〔2〕杜寶漢.淺析洱海生態環境可持續發展〔J〕.生態經濟，1999（4）：56-58.

〔3〕彭文啟，王世巖，劉曉波.洱海水質評價〔J〕.中國水利水電科學研究院學報，2005，3：192-198.

〔4〕王蕓.洱海夏秋季藍藻種群動態變化及水華成因分析〔J〕.大理學院學報，2008，7（12）：39-42.

〔5〕安鑫龍，李雪梅，魯洪斌，等.赤潮微藻的分離方法〔J〕.河北漁業，2010，5（19）：48-49.

〔6〕常鋒毅，潘曉潔，康麗娟，等.洱海螺旋魚腥藻生長生理特性的初步研究〔J〕.水生生物學報，2009，33（3）：385-389.

〔7〕李志偉，崔力拓，齊鳳生，等.銅綠微囊藻生長特征及營養鹽對其生長的影響〔J〕.水利漁業，2006，26（1）：65-66.

〔8〕艾驥.溶藻細菌770SH、802SH的分離、鑒定及溶藻特性的研究〔D〕.武漢：華中農業大學，2008：20-21.

〔9〕Bideh Shukla，Lal Chand Rai.Potassium-induced inhibition of nitrogen and phosphorus metabolism as a strategy of controlling Microcystis blooms〔J〕.World J Microbioal Biotechnol，2007，23（3）：317-322.

〔10〕呂興菊，朱江，孟良.洱海水華藍藻多樣性初步研究〔J〕.環境科學導刊，2010，29（3）：32-35.

〔11〕牛丹丹，鄭青松，劉兆普，等.溶藻細菌YZ對銅綠微囊藻的溶藻特性研究〔J〕.中國環境科學，2011，31（2）：321-326.

A Study on the Growth and Some Physiological Characteristics of Microcystis aeruginosa Isolated from Erhai Lake

NI Zhaolin1,WANG Tao2,ZHANG Ling1,LIN Lijia1,YANG Guanying1,ZHANG Yi2,SHEN Yuanying1*
（1.College of Public Health,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；2.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study on the growth law and some physiological characteristics of Microcystis aeruginosa isolated from Erhai lake.Methods:Purified Microcystis aeruginosa was separated with water droplets method and the spread plate method.Microscopic was used to count the density of algal cells；chlorophyll and carotenoid were extracted with 90%acetone and ELIASA determination of its content.Results:Microcystis aeruginosa cells density was in a linear relationship with OD665,R2=0.993 1；algal cell growth rate in sixth days reached a maximum of 0.524；chlorophyll and carotenoid content increased gradually over time.Conclusion:This Microcystis aeruginosagrowth is in line with the“S”shaped curve；cell density and absorbance is linearly related and the growth rate of the maximum on the sixth day.

Erhai lake；Microcystis aeruginosa；isolate；growth curve；chlorophyll a

Q939.9

A

1672-2345（2013）04-0048-03

云南省教育廳科學研究基金資助項目（2012J045）；大理學院洱海保護研究專項課題基金資助項目（KYRH201005）

2012-09-15

2012-10-05

倪兆林，碩士研究生，主要從事流行病與衛生統計學研究.

（責任編輯 毛本勇）

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.04.013

*通信作者：申元英，教授.