甲型流感病毒PB1-F2蛋白功能的研究進(jìn)展

資海榮，李偉，李婕，周丹，衛(wèi)平民

(東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京 210091)

流感病毒(influenza virus)屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，根據(jù)病毒核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)的基因特征，分為甲(A)型、乙(B)型和丙(C)3型。其中，甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)在自然界中分布廣泛，可以感染多種禽類和哺乳動(dòng)物，并在人群中不斷傳播而引發(fā)世界大流行［1］。

甲型流感病毒為單股負(fù)鏈RNA病毒，其基因組包括8 個(gè)獨(dú)立的片段，即 PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS，其中，2001年 Chen等在對(duì) A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的研究中發(fā)現(xiàn)了一種不屬于流感病毒任何已知開放閱讀框(open reading frame，ORF)編碼的多肽，即PB1-F2［2］。該蛋白是導(dǎo)致甲型流感病毒致病性的關(guān)鍵蛋白之一，在1968、1957和1918年的3次流感大流行的流感病毒中均發(fā)現(xiàn)了這種蛋白。Gibbs等［3］研究發(fā)現(xiàn)，PB1-F2可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)。此外，PB1-F2在某些流感病毒感染宿主過程中具有增強(qiáng)病毒聚合酶活性以及特異的抗原表位，通過加劇宿主的炎癥反應(yīng)，提高病毒毒力［4-5］。

1 PB1-F2蛋白的結(jié)構(gòu)特征

Bruns等［6］研究發(fā)現(xiàn)，sPB1-F2受分別位于氨基末端和羧基末端的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的寡聚蛋白調(diào)節(jié)。PB1-F2蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性取決于溶劑的疏水性，其羧基末端不是一個(gè)完全兩性的分子，而是一個(gè)帶正電的、含有PB1-F2線粒體靶向序列的α螺旋結(jié)構(gòu)，分子螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)隨著溶液的親水性增加而逐漸消失。研究者利用H-NMR光譜分析方法證明，羧基末端具有很強(qiáng)的α-螺旋的性質(zhì)，氨基酸殘基位于Ile(55)到Lys(85)之間，并由不規(guī)則卷曲過渡到較弱的α-螺旋，氨基末端位于Trp(9)到Lys(20)之間。PB1-F2所具有的寡聚性以及α螺旋形的結(jié)構(gòu)可以用由sPB1-F2與線粒體膜進(jìn)行交互作用加以模擬［6-7］。Gibbs等［3］在 Hela 細(xì)胞中PB1-F2-EGFP融合蛋白的表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)了PR8的PB1-F2的羧基端的一段氨基酸序列，預(yù)測(cè)并證實(shí)這段序列可形成帶正電荷的兩親性α-螺旋。而帶有正電荷的兩親性螺旋結(jié)構(gòu)一般被認(rèn)為是幫助蛋白定位到線粒體的結(jié)構(gòu)［8］，也被認(rèn)為是PB1-F2定位在線粒體內(nèi)膜的必需結(jié)構(gòu)。此外，研究者通過一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PB1-F2蛋白氨基端46～75位氨基酸殘基是PB1-F2定位在線粒體所必需的肽段。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸殘基63～75位和第73位賴氨酸(Lys)、第75位精氨酸(Arg)是PB1-F2蛋白的MTS定位于線粒體所必需的。在細(xì)胞中，PB1-F2的表達(dá)可以引起線粒體的分布和形態(tài)改變，導(dǎo)致線粒體跨膜電勢(shì)去極化，使線粒體失去膜電位。不同的流感病毒毒株的PB1-F2蛋白在病毒感染過程中因序列變化和線粒體定位的差異，其功能也有所不同。

Zell等［9］通過分析來自GenBank的甲型流感病毒1 864個(gè)樣本的PB1-F2基因序列發(fā)現(xiàn)，編碼PB1-F2蛋白基因片段的同義突變與非同義突變的置換率高于編碼PB1蛋白的基因片段，并由此推斷，由于PB1-F2蛋白的表達(dá)，使甲型流感病毒的致病性增強(qiáng)，變異性亦增強(qiáng)。1918年西班牙流感野生型流感株是最早發(fā)現(xiàn)的含有至少87個(gè)氨基酸的完整型PB1-F2，1956年發(fā)現(xiàn)了第57位氨基酸殘基終止的斷裂型PB1-F2，2009年首次發(fā)現(xiàn)了含有12個(gè)氨基酸殘基的斷裂型PB1-F2［10］。Zell等［9］研究發(fā)現(xiàn)，除 H5N2、H6N6、H9N2、H13N2之外，大多數(shù)禽流感病毒編碼完整型的PB1-F2，不同的宿主、不同的亞型病毒株的PB1-F2長(zhǎng)度存在差異，而不同長(zhǎng)度的PB1-F2的甲型流感病毒株的基因序列在宿主細(xì)胞中的定位以及在宿主細(xì)胞中的分子功能亦存在差異［5］。因此，PB1-F2蛋白存在不同長(zhǎng)度、不同氨基酸序列、不同的分子定位、不同的功能，表現(xiàn)為毒株特異性致病性。

2 PB1-F2蛋白的功能

2.1 PB1-F2蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

Zamarin等［11］通過用M30阻抗劑(切冬酶裂解細(xì)胞角蛋白)處理轉(zhuǎn)染了PB1-F2的293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞易于被腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)誘導(dǎo)凋亡;他們同時(shí)設(shè)立對(duì)照組并發(fā)現(xiàn)在無任何促凋亡因子存在的情況下，細(xì)胞發(fā)生了凋亡的現(xiàn)象，結(jié)果表明PB1-F2蛋白具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，結(jié)論與用敲除PB1-F2的突變病毒感染小鼠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)［11］相一致。同時(shí)，研究還表明PB1-F2的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用是可以被Bcl-xl所阻抗。PB1-F2蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用是通過破壞細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)并使線粒體內(nèi)膜形成凋亡孔，導(dǎo)致宿主細(xì)胞通透性的改變從而促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮作用，誘導(dǎo)線粒體促細(xì)胞凋亡因子tBid的促細(xì)胞凋亡的作用。然而，Bcl-xl的過度表達(dá)則不能抑制PB1-F2蛋白對(duì)線粒體破壞作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PB1-F2蛋白發(fā)生誘導(dǎo)凋亡的作用主要是通過線粒體內(nèi)膜ANT3通道和線粒體外膜VDAC1通道發(fā)揮的，并且ANT3通道主要是通過與蛋白羧基端發(fā)生交互作用，而VDAC1通道與蛋白的羧基端與氨基端均可發(fā)生交互作用從而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，Zamarin等在使用ANT3阻抗劑使得線粒體內(nèi)膜ANT3不能發(fā)揮作用的情況下，未發(fā)現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，從而驗(yàn)證線粒體內(nèi)膜ANT3通道。然而，由于到目前為止未發(fā)現(xiàn)VDAC1通道阻抗劑，因此無法驗(yàn)證VDAC1通道在促凋亡過程中的作用。根據(jù)一系列的研究分析推測(cè)，PB1-F2促凋亡作用的機(jī)制有三:第一，通過線粒體內(nèi)膜ANT3通道和線粒體外膜VDAC1通道，PB1-F2蛋白僅僅是這兩個(gè)通道的中間橋梁，起增強(qiáng)作用;第二，PB1-F2蛋白通過作用于線粒體的細(xì)胞內(nèi)膜與線粒體外膜，對(duì)ANT3和VDAC1通道起到鏈接的作用;第三，PB1-F2蛋白同時(shí)作用于線粒體的細(xì)胞內(nèi)膜與線粒體外膜，直接導(dǎo)致細(xì)胞通透性的改變從而促使細(xì)胞的凋亡。最近的研究［13］結(jié)果表明，PB1-F2蛋白與Bcl-2家族促細(xì)胞凋亡因子的功能類似。

PB1-F2蛋白的促細(xì)胞凋亡作用是建立在PB1-F2蛋白含有線粒體靶向序列(MTS)的基礎(chǔ)上，而含有MTS的PB1-F2至少含有87個(gè)氨基酸［3］，因此，促細(xì)胞凋亡的功能只局限于含有87個(gè)以上氨基酸的PB1-F2毒株。而且PB1-F2的促細(xì)胞凋亡是促進(jìn)宿主的免疫細(xì)胞的凋亡，而并非上皮細(xì)胞［2］。

此外，對(duì)于PB1-F2對(duì)線粒體功能的研究一般都是局限于體外研究，PB1-F2在人體內(nèi)流感病毒感染人體時(shí)所發(fā)揮的作用仍然有待進(jìn)一步的探討。

2.2 PB1-F2蛋白增強(qiáng)病毒聚合酶活性

聚合酶復(fù)合物由病毒蛋白PB2、PB1和PA組成，是決定病毒RNA合成過程的重要因子之一［14］。病毒聚合酶復(fù)合物與流感病毒NP蛋白組成核糖核蛋白復(fù)合體(vRNP)，其中NP主要功能是促進(jìn)其包裹的RNA片段被聚合酶復(fù)合物識(shí)別。

Mazur等［15］利用 PR8感染人肺腺癌上皮細(xì)胞A549，發(fā)現(xiàn)在病毒復(fù)制的初期階段PB1-F2蛋白的表達(dá)水平與病毒NP以及PB1相當(dāng)，但經(jīng)過幾個(gè)復(fù)制周期之后，PB1-F2蛋白表達(dá)水平明顯下降，與此同時(shí)，在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均發(fā)現(xiàn)PB1-F2蛋白的表達(dá)。由此得到結(jié)論:PB1-F2蛋白具有的功能不僅限于定位在線粒體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，它還具有其他的功能。利用敲除PB1-F2的PR8病毒和PR8野生株分別感染MDCK細(xì)胞作空斑滴定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，敲除PB1-F2的PR8病毒形成的空斑直徑明顯小于PR8野生株在MDCK細(xì)胞上形成的空斑直徑。一般認(rèn)為空斑滴定實(shí)驗(yàn)是與聚合酶活性有著很大的關(guān)系［16］。Mazur等在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在敲除PB1-F2的情況下，流感病毒的聚合酶活性顯著降低，意味著PB1-F2可能在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮重要作用。

此外，有學(xué)者［17］還發(fā)現(xiàn)，部分PB1-F2可以與流感病毒蛋白PB1結(jié)合，但并不結(jié)合其他聚合酶成分如NP或PB2蛋白。實(shí)驗(yàn)表明，在敲除PB1-F2蛋白的情況下，流感病毒蛋白PB1的定位發(fā)生改變，主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。由此推測(cè)，PB1-F2可以通過結(jié)合PB1的方式將部分PB1滯留在細(xì)胞核中，其作用可能是通過阻止PB1過早地由細(xì)胞核中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，以此來延長(zhǎng)聚合酶在細(xì)胞核中的時(shí)間，達(dá)到保證聚合酶活性的目的［16］。通過反向遺傳學(xué)和基因重排的方法可獲得表達(dá)全長(zhǎng)PB1-F2的甲流病毒，并與其他一系列含有PB1-F2的毒株比較，系統(tǒng)分析PB1-F2的表達(dá)對(duì)病毒聚合酶活性的影響，研究包括PB1的合成和在細(xì)胞內(nèi)的定位以及病毒在小鼠體內(nèi)復(fù)制中的差異。結(jié)果顯示，PB1-F2蛋白的表達(dá)對(duì)聚合酶活性、PB1的合成和病毒復(fù)制的影響主要是依賴于感染宿主細(xì)胞的種類和毒株的種類。然而，在季節(jié)性流感病毒H3N2毒株中，通過敲除PB1-F2突變重組改變H3N2毒株的閱讀框架，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除PB1-F2蛋白的H3N2病毒在感染宿主過程中，PB1的合成及聚合酶的活性均未發(fā)生顯著變化。研究表明PB1-F2對(duì)聚合酶的影響并不是其普遍的功能，僅與特定的毒株相關(guān)。在其他毒株上敲除PB1-F2或者在1918年或1957年大流行的H1N1病毒中表達(dá)全長(zhǎng)PB1-F2蛋白，均對(duì)甲流病毒在小鼠肺部的復(fù)制沒有影響。因此，推測(cè)PB1-F2還可通過其他途徑影響病毒感染過程，提高流感病毒在哺乳類宿主中的毒力［18］。

近來研究［19］也發(fā)現(xiàn)，PB1-F2蛋白通過結(jié)合PB1蛋白調(diào)控病毒RNA(vRNA)聚合酶活性。同時(shí)進(jìn)一步證明，PB1-F2蛋白可以增加PB1的蛋白表達(dá)水平和宿主細(xì)胞中vRNA的表達(dá)水平。此外，更多的vRNA表達(dá)會(huì)引起其他病毒蛋白NP、Ml和NS1的表達(dá)增加。將PB1-F2蛋白的氨基端(1～50位)和羧基端(51～87位)分別在MDCK細(xì)胞中表達(dá)，然后感染敲除PB1-F2的PR8突變病毒，結(jié)果顯示PB1-F2的氨基端可以增加PB1的蛋白表達(dá)水平，而羧基端則沒有表現(xiàn)出該功能。因此，PB1-F2的氨基端對(duì)病毒的復(fù)制可能起著重要的正調(diào)控作用。此外，Mitzner等［19］在研究中發(fā)現(xiàn)，在感染宿主細(xì)胞過程中，無論是PR8流感毒株P(guān)B1-F2，還是在體外合成的PB1-F2片段均可被純化的蛋白激酶(PKC)或細(xì)胞裂解物所磷酸化。通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)以及DNA突變分析發(fā)現(xiàn)，PKCα與PB1-F2存在相互結(jié)合作用。PKC抑制劑預(yù)處理的細(xì)胞中PB1-F2的磷酸化被減弱，而PKC激活劑PMA預(yù)處理的細(xì)胞中PB1-F2的磷酸化有所增強(qiáng)。通過電噴霧質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，PB1-F2的35位絲氨酸(Ser-35)、27位蘇氨酸(Thr-27)均是PKC重要磷酸化位點(diǎn)，前者是最主要的磷酸化位點(diǎn)。如果把PB1-F2的27位和35位磷酸化位點(diǎn)突變，重組的PR8病毒的PB1-F2不再發(fā)生磷酸化，且感染過程中caspase-3的激活減弱，病毒的復(fù)制能力減弱，研究表明PB1-F2被識(shí)別的完整的磷酸化位點(diǎn)對(duì)PB1-F2在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮功能起著重要作用［19］。

2.3 PB1-F2蛋白抗原性

Andreansky等［20］對(duì)H1N1和H3N2流感病毒進(jìn)行反向遺傳學(xué)研究，首先通過給予雌性B6小鼠腹腔注射甲型流感H1N1病毒的-NP-PA，然后改為通過鼻腔途徑給予甲型流感H3N2病毒的-NP-PA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小鼠的脾臟存在大量的 CD8+KbPB1703+、CD8+KbNS2114+和CD8+DbPB1-F262+，支氣管肺泡中存在大量炎癥細(xì)胞。然而，當(dāng)將初免-加強(qiáng)免疫的處理順序反過來，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與之前的效應(yīng)并不相一致。將被病毒所感染的細(xì)胞作為探針，用固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)分析所有的反應(yīng)，二次免疫應(yīng)答所引起的免疫細(xì)胞大量地克隆增殖，研究表明初免-加強(qiáng)免疫策略暴露于含有-NP-NA的病毒所引起總的效應(yīng)量不同于暴露于未加處理的病毒感染所引起的效應(yīng)量。初免也得到同樣的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)表明，完整的PB1-F2蛋白上存在特異的抗原表位，能誘導(dǎo)宿主體內(nèi)免疫T細(xì)胞的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)還顯示，小鼠感染表達(dá)完整PB1-F2的流感毒株后，小鼠脾臟和呼吸道中CD8 DbPB1-F262+T細(xì)胞高度表達(dá)，而這些發(fā)現(xiàn)將對(duì)自然感染和疫苗的研制有著重要的啟示。

Andreansky等還通過實(shí)驗(yàn)推測(cè)，抗原濃度、抗原的活性、T細(xì)胞抗原受體限制譜、T細(xì)胞抗原受體活性可能影響二次免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體的量，因此，可以通過研究對(duì)這些因素影響的大小，開發(fā)基于CD8T的細(xì)胞肽疫苗以對(duì)抗病毒的感染以及致瘤的過程。然而對(duì)于PB1-F2蛋白抗原性的研究相對(duì)較少，有待更進(jìn)一步的研究。

2.4 PB1-F2促進(jìn)炎癥反應(yīng)

Peltola等［21］讓幼年雪豹首先感染不同型別的流感病毒，然后感染肺炎鏈球菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)十分之九的感染H3N2流感病毒的幼雪豹發(fā)生了鼻竇炎或中耳炎，只有十一分之一的幼雪豹在感染H1N1或B型流感之后發(fā)生了鼻竇炎或中耳炎。研究結(jié)果表明，不同型別的流感病毒所引起的肺炎鏈球菌感染存在差異，由此推測(cè)流感病毒不同的亞型之間毒力因子存在差異。

PB1-F2蛋白作為新近被發(fā)現(xiàn)的流感病毒重要的毒力因子，對(duì)甲型流感病毒導(dǎo)致疾病發(fā)生起著重要的作用。PB1-F2蛋白在1918年甲流大流行時(shí)起到重要作用，研究［21］表明感染了甲型流感病毒的大鼠肺部出現(xiàn)了嚴(yán)重的病理學(xué)改變和致命的肺炎球菌感染。有記錄以來發(fā)生的最嚴(yán)重的人流感大流行是在1918年至1919年，這次的大流行導(dǎo)致了全球5 000萬(wàn)人死亡［16］，其中絕大多數(shù)患者的死亡原因都被認(rèn)為是二次細(xì)菌性肺炎。二次細(xì)菌性肺炎在以往均被認(rèn)為是由病毒感染所引起的，而Sethi等［22］的研究結(jié)果表明，二次細(xì)菌性肺炎是在甲型流感病毒的發(fā)生之后出現(xiàn)的，主要病原體是肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PB1-F2蛋白是導(dǎo)致肺部二次感染的重要致病因子［23-24］。而PB1-F2蛋白致病性增強(qiáng)的主要原因是破壞肺泡巨噬細(xì)胞［23］。

研究者利用PB1-F2蛋白斷裂型的毒株與PB1-F2蛋白完整型的病毒分別感染小鼠，與感染斷裂型PB1-F2蛋白的PR8菌株的小鼠相比，感染完整型PB1-F2蛋白的小鼠肺部出現(xiàn)了由肺炎鏈球菌導(dǎo)致的損壞和大量的細(xì)胞因子聚集。這種差異表現(xiàn)為受病毒感染后的第7天，在小鼠支氣管肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)有大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞增加。研究表明并非所有的含PB1-F2蛋白菌株的甲型流感病毒都會(huì)引起二次細(xì)菌感染導(dǎo)致的肺損傷。實(shí)驗(yàn)過程中PB1-F2蛋白可引起宿主血液炎癥細(xì)胞增加、血清細(xì)胞因子升高和肺組織細(xì)菌量的增加［25］。正常情況下呼吸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生黏液，并清除入侵的病原體和顆粒物質(zhì)。病毒感染后PB1-F2蛋白破壞了呼吸道上皮細(xì)胞，使其纖毛和產(chǎn)生的黏液減少，清除功能嚴(yán)重受損，細(xì)菌在肺中的停留時(shí)間增加，增加了肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和流感嗜血桿菌等的繼發(fā)感染機(jī)會(huì)，致使宿主死亡率升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PB1-F2蛋白中特定的氨基酸對(duì)病毒致病性的增加有著關(guān)鍵性作用。通過鼻腔途徑讓小鼠感染保留羧基端的PB1-F2蛋白的病毒株，小鼠肺中出現(xiàn)類似感染PR8野生型流感菌株的表現(xiàn)，存在大量的巨噬細(xì)胞和嗜中粒細(xì)胞。而保留氨基端的PB1-F2蛋白卻未發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象。結(jié)果表明，PB1-F2蛋白主要通過羧基端作用使免疫細(xì)胞聚集在肺內(nèi)，導(dǎo)致二次細(xì)菌性感染引起肺損傷。然而，到目前為止，尚無關(guān)于1918年的流感大流行的毒株所引起肺部巨噬細(xì)胞和嗜中粒細(xì)胞增加以及疾病發(fā)生的分子學(xué)機(jī)制的研究。

此外，最近研究［26］發(fā)現(xiàn)，在香港(1997 年，H5N1)和Brevig Mission(1918年，H1N1)流感毒株中PB1-F2的第66位堿基發(fā)生點(diǎn)突變，產(chǎn)生氨基酸N66S，并證實(shí)其具可提升流感病毒的致病性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，N66S可能主要是通過延遲先天性免疫反應(yīng)，抑制早期干擾素的作用，使病毒快速增長(zhǎng)，并最終導(dǎo)致嚴(yán)重肺部免疫以及病理改變。而N66S對(duì)斷裂型及完整型PB1-F2蛋白流感毒株功能的影響有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 語(yǔ)

甲型流感病毒引起流感大流行的潛在威脅引起了廣泛關(guān)注，大量的研究表明PB1-F2蛋白為甲型流感病毒致病的重要毒力因子，PB1-F2蛋白與甲型流感病毒作用于不同宿主所產(chǎn)生的致病性強(qiáng)弱是否存在著必然聯(lián)系，以及PB1-F2蛋白影響流感病毒致病性的作用分子機(jī)制還需要更進(jìn)一步的研究，為當(dāng)前可能發(fā)生的人流感大流行提供應(yīng)對(duì)思路。

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