microRNA在預防醫學中的研究進展

張迎建，李文超，楊紅

(東南大學公共衛生學院環境醫學工程教育部重點實驗室，江蘇南京 210009)

microRNA(miRNA)是一類長度約為22個堿基的微小RNA，能夠在轉錄后水平上調節蛋白質的翻譯。它具有高度保守序列，不編碼蛋白質，但是能夠通過與靶mRNA的堿基互補配對起作用使其降解或抑制其表達，從而導致特定基因的沉默［1］。一般來說，一個miRNA可以調節幾十個至上百個基因。據推測，人類約有三分之一基因編碼的mRNA受到miRNA的負調控，在生物體的生殖發育和新陳代謝的各個方面均起到調控作用［2-4］。miRNA芯片作為基因組學中新的研究技術為預防醫學研究提供了新的手段。在預防醫學研究中，運用miRNA芯片、測序以及生物信息學技術可闡明環境有害因素的致病機制，而且miRNA作為已知特定環境因素的致病易感基因和一種新的生物標志物，為有效保護易感人群和疾病的早期診斷、治療及預防帶來了新的希望［5］。

1 miRNA概述

1993 年和 2000 年，Lee 等［6］和 Reinhart等［7］相繼在秀麗新小桿線蟲發育過程的研究中發現了一種定時調控胚胎后期發育的miRNA-lin4以及let-7，它們的轉錄產物中有一個長度22 nt的非編碼RNA，lin-4、let-7及其特異靶標翻譯抑制的發現暗示了發育中基因調控的新機制。近幾年又在哺乳動物、魚、蠅和線蟲中鑒定了數百種miRNA。miRNA的合成主要分為細胞核和細胞質兩個部分。在細胞核中，編碼miRNA的基因首先轉錄成初級轉錄本，即pri-miRNA，它在一種核酸內切酶Ⅲ及其輔助因子的作用下剪切為miRNA前體，即pre-miRNA［8-9］。然后，pre-miRNA 通過與核質/細胞質轉運蛋白Exportin 5結合將其轉運到細胞質中，在細胞質中的第二個核酸內切酶ⅢDicer和TRBP復合物的作用下把miRNA前體剪切成雙鏈miRNA［10-11］。最后，雙鏈miRNA雙螺旋解旋，其中的1條結合至RNA誘導沉默復合體上，在其引導下，miRNA與靶mRNA的堿基互補配對，發揮其對基因的表達調控作用［12］。

關于miRNA的作用機制目前主要有翻譯起始抑制、翻譯起始后抑制、mRNA降解、P小體和SG顆粒扣押靶mRNA［13］等幾種觀點，主要表現為兩個方面:mRNA的降解和翻譯抑制。mRNA的特性決定其沉默方式，當它與miRNA不完全互補配對時，僅在某個位點與miRNA互補，那么RNA誘導沉默復合體就不會特異地降解mRNA，只是阻止mRNA作為翻譯的模板而不能合成蛋白質，會抑制翻譯的過程，這種機制多見于動物中;如果它與 miRNA完全互補配對時，該mRNA就會被RNA誘導沉默復合體特異地剪切或降解，這種機制多見于植物中［14-16］。

2 miRNA在預防醫學中的研究進展

2.1 miRNA與毒理學

2.1.1 miRNA與職業毒理學 鎳化合物是人類呼吸道的確認致癌物，為了探討 PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)基因與miR-22在致癌過程中的相互關系，劉林華等［17］以結晶型硫化鎳(NiS)誘導轉化人支氣管上皮細胞第35代(16HBE-T35)及其前期第18代細胞(16HBE-T18)，檢測miR-22成熟體表達量和蛋白表達量，發現miR-22的表達在細胞轉化的不同階段呈現不同的特征，提示NiS誘導的惡變細胞中，miR-22可能對PTEN產生反向調控作用，鑒于PTEN在mRNA水平上表達未改變，作者推測miR-22是在轉錄后水平影響PTEN蛋白的表達。代慧等［18］在細胞水平探討鉻Cr(VI)誘導的L02肝細胞氧化應激狀態及miRNA譜系的改變，結果發現 Cr(VI)濃度為 5 μmol·L－1時，各時間點細胞存活率均接近70%，且在染毒8 h細胞ROS相對熒光強度達峰值169.2%，此時 miR-370、miR-let-7和 miR-125b的表達上調，miR-122和miR-137的表達下調，而miR-298和miR-153表達差異無統計學意義，提示Cr(VI)可激發肝細胞明顯的氧化應激，并在氧化應激的高峰期誘導L02肝細胞出現特征性的miRNA表達譜。

蔡鳳霞等［19］和李煌元等［20］分別研究了錳和百草枯(paraquat，PQ)對大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(PC12)毒性作用以及對miR-133b表達的影響。蔡鳳霞等［19］觀察到300、600 μmol·L－1MnCl2染毒 PC12 細胞 72 h后，活性氧生成水平高于對照組，300 μmol·L－1MnCl2染毒組PC12細胞相對表達水平上調，提示MnCl2可誘導PC12細胞活性氧生成量升高以及miR-133b的表達上調，但PC12細胞miR-133b的表達與MnCl2染毒濃度之間無劑量-效應關系。李煌元等［20］分別以 0、50、100、300 μmol·L－1PQ 染毒 PC12 細胞24 h 后，發現 100、300 μmol·L－1染毒組細胞存活率下降，細胞凋亡率升高，300 μmol·L－1PQ 染毒組細胞miR-133b表達上調，表明PQ致PC12細胞損害和細胞凋亡時miR-133b的表達上調，miR-133b可能在PQ的神經毒性作用中發揮一定作用。

Wang等［21］評估了氟蟲腈、三唑磷和它們的復配劑原藥及其微乳劑經口染毒斑馬魚96 h后魚組織中miRNA的表達，結果表明三唑磷和氟蟲腈的原藥和微乳劑對斑馬魚組織中miRNA表達的影響不同，雖然三唑磷與氟蟲腈的聯合殺蟲作用是相加的，但三唑磷、氟蟲腈致斑馬魚組織中miRNA的差異表達與它們的復配劑間無重疊，提示miRNA可以作為農藥毒性作用的生物標志物。在另一項有關三唑磷和氟蟲腈引起斑馬魚miRNA表達組織特異性的實驗研究中，張羽等［22］發現，三唑磷、氟蟲腈、助劑及復配劑對斑馬魚miR-21、miR-128、miR-155和miR-181a的表達影響存在組織特異性，該結果為miRNA的功能研究和農藥作用部位定位及作用方式的研究指出了可能的方向。Zhang等［23］報道了miRNAs在黑索今炸藥即環三次甲基三硝基胺(RDX)誘導神經毒性中的作用，發現許多miRNA表達有組織特異性，腦組織中上調表達的7個miRNAs(let-7e、miR-98、miR-361、miR-26b、miR-125a-5p、let-7i和let-7f)在肝組織中下調表達，相反肝組織中上調表達的另外7個miRNAs(miR-126-3p、miR-23b、miR-27a、miR-29a、miR-29c、miR-451 和 miR-690)在腦組織中表達下調，經RDX染毒miR-206的表達增加了26倍。此外與癌癥發生相關的miRNAs亦有異常表達，如 let-7、miR-17-92、miR-10b、miR-15、miR-16、miR-26和miR-181，提示這些miRNA可能與RDX的致癌性有關。

綜上所述，在職業毒理學中，重金屬、農藥等多種職業有害毒物可引起活性氧水平、氧化應激、細胞凋亡及蛋白表達等改變，而miRNA參與疾病發生的各個環節，提示可作為疾病發生發展的生物標志物。

2.1.2 miRNA與環境毒理學 苯并(a)芘(B［a］P)是導致肺癌的最重要的因素之一。段慧涵等［24］以1.00 μmol·L－1的 B［a］P 染毒原代培養小鼠支氣管上皮細胞12、24及48 h后，染毒小鼠支氣管上皮細胞的miR-320表達水平上調且呈現明顯的時間依賴關系，提示miR-320可以通過對細胞周期素依賴性激酶6表達的調控影響B［a］P暴露細胞的細胞周期。在B［a］P 的代謝終致癌物反式-7，8-二羥-9，10-環氧苯并芘(anti-BPDE)誘導的惡變細胞中有多種miRNA表達的異常改變。劉林華等［25］通過B［a］P的代謝物anti-BPDE誘導的惡性轉化第30代人支氣管上皮細胞(16HBE-T30)及其前期第15代細胞(16HBE-T15)模型，發現在16HBE-T30細胞中miR-494、miR-22的表達上調，而PTEN蛋白表達下調，在16HBE-T15細胞中上述兩種miRNA的表達水平下調;表明anti-BPDE惡性轉化細胞中的miR-494和miR-22在轉錄后水平對PTEN進行反向表達調節，阻止細胞凋亡，增加細胞集落形成率和惡性程度，具有類癌基因的功能，在B［a］P的致癌作用中發揮重要作用。吳延等［26］研究發現，轉染前16HBE-T30中miR-17-5p的表達水平上調，轉染后轉染miR-17-5p抑制劑組的miR-17-5p表達水平下調，與抑制劑陰性對照組相比，細胞增殖活力下降、細胞周期阻滯、凋亡率上升及克隆形成率下降;轉染miR-17-5p模擬物組中細胞的miR-17-5p表達水平上調，其增殖活力增加、凋亡率降低、克隆形成率升高。李仲杰［27］關于 miRNAs參與7，8-二氫二醇-9，10-環氧苯并(a)芘誘發的FL細胞應答反應的研究證實，miRNA參與anti-BPDE引起的FL人羊膜上皮細胞早期應答反應，miR-509-5p是FL細胞對BPDE暴露早期應答的一個分子標志物，CDCI4B、DOCK4等7個靶基因受miR-509-5p的轉錄后調節。張艷秋等［28］予小鼠經口灌胃50 mg·kg－1B［a］P，結果發現與對照組(等量橄欖油)比較，B［a］P染毒組小鼠肺組織中共有差異表達miRNA 109個，其中表達水平上調的miRNA 50個，表達水平下調的59個，TargetScan、miRanda以及picTar軟件靶基因預測顯示，其中下調較為明顯的miR-20b可能是通過調節細胞增殖、周期等相關的蛋白參與調控B［a］P介導的細胞和機體損傷過程。作者指出miRNA對于B［a］P暴露可以產生特異性的表達改變，而且差異表達的miRNA可能在B［a］P導致機體損害過程中起著重要作用。

硫代硫酸鈉(sodium thiosulfate，STS)是廣泛應用于食品加工業、造紙業、感光工業、染料制造和醫藥工業的一種硫的衍生物。Hu等［29］將斑馬魚胚胎分別用1 ×10－6～1 mol·L－1的 STS 溶液染毒，結果顯示0.1 ～1 mol·L－1STS染毒的斑馬魚胚胎呈現出嚴重的發育遲緩，并伴隨多臟器畸形;利用LNA修飾的miRNAs探針行胚胎整體原位雜交結果顯示，miR-124a和miR-133a呈現差異表達。提示硫的衍生物誘發斑馬魚胚胎畸形過程中的一個重要分子事件是神經系統miRNAs表達降低，其致畸的分子機制可能是miRNAs與其靶基因或對其靶基因上游區之間的相互作用。在一項有關環境中納米材料對植物影響的研究中，Burklew等［30］將滅菌的成熟煙草種子分別暴露于0%、0.1%、0.5%和1%的三氧化二鋁納米粒子中，在室溫下培養3周后發現，隨著三氧化二鋁納米粒子濃度的增加，煙草幼苗的平均根長、葉數、生物量減少。經RT-qPCR檢測發現:在暴露于0.1%的氧化鋁納米粒子的煙草幼苗中，除了miR-156、miR-157和miR-172表達水平上調外，其他的miRNA的表達水平都是下調的;在所有表達水平上調的miRNA中，暴露于1%的氧化鋁納米粒子的幼苗中的miR395、miR397、miR398和miR399的表達水平差異倍數最大。研究表明三氧化二鋁納米粒子影響煙草幼苗的生長和發育，作者推測miRNA可能在納米三氧化二鋁對煙草幼苗的應激反應中起著重要的調控作用。

在環境毒理學中，應用細胞、小鼠、大鼠、斑馬魚、植物等不同的模式生物探討環境有害毒物對生物體的影響過程中，miRNA參細胞周期的調控，細胞凋亡，影響生物的生長和發育，提示差異表達的miRNA可能在導致生物體損害過程中起著重要作用。

2.1.3 miRNA與食品毒理學 黃曲霉毒素 B1(AFB1)是人類原發性肝癌的主要致病因素之一，AFB1誘導肝癌發生的機制尚不明了。李志芳等［31］利用miRNA芯片技術檢測其miRNA表達譜發現，L02和L02T兩組細胞中差異表達的miRNA有25個，對其中表達水平上調顯著的miR-638進行靶基因預測，篩選到4個與癌癥發生發展相關的潛在靶基因。研究提示差異表達的miRNA可能在細胞的惡性轉化過程中起著重要作用，具有類似癌基因或者抑癌基因的作用。而在另一項相似研究中，羅曉婷［32］發現差異表達的miRNA有8個，上調基因中差異較顯著的是hsa-miR-671-5p，下調基因中差異較顯著的是hsa-miR-96，它們與蛋白合成、免疫系統、細胞生理功能密切相關。研究表明AFB1可以引起惡性轉化L02細胞中miRNA表達譜的改變。連俊偉［33］探討了miRNA在AFB1致大鼠急性毒性作用中的作用機制，研究表明AFB1對大鼠有毒性作用，可誘導機體的miRNA異常表達，其中miR-34a可以抑制細胞的生長，可能在AFB1致毒通路中起作用。

丙烯酰胺(ACR)是富含碳水化合物和氨基酸的食品在高溫加熱下發生美拉德反應產生的，其對人體存在潛在的危害作用。王菊等［34］以10 mmol·L－1濃度的ACR處理受精后6h(6hpf hours past fertilization)的斑馬魚胚胎后發現，染毒ACR組出現多系統的畸形。用核苷酸鎖定(LNA locked nucleic acid)標記的miRNA探針進行胚胎6 hpf染毒后整體原位雜交(72 hpf)，結果表明調節斑馬魚神經系統發育的miR-124、miR-125b、miR-9、miR-21、miR-140、miR-206等表達水平上調，調節肌肉心臟發育的miR-1、miR-133a表達水平下調，提示ACR會影響斑馬魚胚胎發育過程中miRNA的表達。

大腦對酒精非常敏感。Sathyan等［35］研究發現，酒精濃度在醉酒水平(69.57 mmol·L－1)可顯著抑制胎齡12.5 d胎鼠大腦皮層神經細胞的miR-21、miR-335、miR-9和miR-153 4種miRNAs;而在生活中飲酒經常會達到的酒精濃度(13.04 mmol)卻可誘導miR-335表達增加。Sathyan等進一步驗證GABAAR受體拮抗劑——印防己毒素可拮抗酒精對miR-21表達的抑制作用，但對酒精抑制miR-335表達無拮抗作用。表明酒精可通過GABAAR受體依賴的機制抑制miR-21表達，通過非GABAAR受體依賴的機制抑制miR-335表達。采用反義RNA抑制miR-21表達可致細胞凋亡，提示miR-21是一種神經細胞凋亡抑制因子。相反，敲除miR-335則在促進細胞增殖同時預防因miR-21抑制而引起的死亡，說明miR-335在功能上是miR-21的拮抗劑，由此解釋了酒精處理的神經細胞能夠抗凋亡的原因。

綜上所述，miRNA在食源性疾病的發生過程中起了很重要的作用，ACR會影響斑馬魚胚胎發育過程中miRNA的表達，AFB1可誘使機體的miRNA發生異常表達，酒精可誘導miR-335表達增加等。

2.1.4 miRNA與放射毒理學 胡錚和馮先武等［36-37］對電離輻射誘導miRNA表達的研究進展作了綜述，指出miRNA可以參與細胞輻射敏感性的調節;miRNA可能在輻射誘導旁觀者效應中發揮作用以及輻射誘導miRNA的表達變化具有性別特異性;電離輻射可以引起細胞周期阻滯、凋亡、纖維化、致癌等一系列生物反應，能在不同的組織和細胞中誘導miRNA的表達，而且輻射誘導miRNA的表達多依賴輻射劑量和照射時間等因素。近來孫秀錦［38］采用濃度分別為1.85×107、5.55 ×107和16.65 ×107Bq·ml－1的氚水內照射小鼠建立模型，高低劑量組于染毒后10 d處死，中劑量組分別于染毒后 2、4、6、10、28 d 處死，采用 miRNA芯片技術篩選miRNA差異表達改變發現:與對照組比較，初始注入量同為5.55×105Bq·g－1，分別染毒2 d及10 d的小鼠肝臟組織miRNA表達不同，其中表達均上調的miRNA有4個，表達均下調的miRNA有3個;初始注入量5.55×105Bq·g－1，染毒2 d時共有41個miRNA發生了差異性表達改變，而到了第10 d，則只有20個miRNA差異性表達改變。還有就是miRNA在輻射誘導腫瘤過程中可以發揮促進和抑制作用，高崗［39］利用miRNA芯片篩選α粒子誘發人支氣管上皮細胞(BEPZD)惡性轉化不同時期差異表達的miRNA，發現與人支氣管上皮細胞比較，第20代細胞(RH 20)中存在38個差異表達miRNAs，RH 20和第35代細胞(RHT 35)中變化一致的差異表達miRNAs有25個，RHT35細胞中存在87個差異表達miRNAs;與RH 20細胞相比，RHT 35細胞中存在38個差異表達miRNAs。研究結果提示miRNAs與α粒子誘發細胞惡性轉化過程密切相關。

2.2 miRNA與衛生學

衛生學包括職業衛生學、放射衛生學、營養與食品衛生學等。Wang等［40］在一項病例對照研究中，評價了 pre-miRNAs(miR-146a、miR-149、miR-196a2 和miR-499)中 4 個 SNPs(rs2910164、rs2292832、rs11614913和rs3746444)與煤工塵肺危險度之間的關系，發現miR-149 rs2292832 TT基因型與CT/CC基因型相比煤工塵肺危險度明顯增加，而且這種危險度的增加在年齡≥68歲、煤塵暴露≥26年和曾經吸煙者之間表現很明顯，另外基因型和Ⅱ、Ⅲ期患者之間有明顯的關聯，表明miR-149 rs2292832的單核苷酸多態性與煤工塵肺發生的易感性有關。

氡(222Rn)普遍存在于環境空氣中，是引起人類肺癌的主要因素。高剛［39］選擇40例高氡暴露地區居民肺癌組織標本蠟塊以及5例對照肺組織標本蠟塊，發現高氡暴露地區居民肺癌組織中let7a/c/f、miR-29a/b/c、miR-34a/b/c和miR-200a/b的表達水平顯著下調，表明let-7、miR-29、miR-34家族以及 miR-200a/b在氡致肺癌和肺損傷過程中具有重要作用。秦宏冉［41］將我國四川省若爾蓋地區一處異常高氡溫泉周圍97名藏族居民作為高氡組，對照組為49人，發現高氡組(n=22)let-7a和miR-145表達水平下調，而miR-34a和miR-34b表達水平升高，分別是對照組的15.7倍和351.24倍。高氡組miR-34a/b表現出異常高表達，研究提示可能是輻射損傷的早期標記。

Chartoumpekis等［42］用 C57BLJ6 小鼠研究脂肪組織中miRNA在肥胖過程中的意義，發現高脂飲食后共有差異表達miRNA 22個，首次發現在肥胖過程中mmu-miR-342-3p、mmu-miR-142-3p、mmu-miR-142-5p、mmu-miR-21、mmu-miR-146a、mmu-miR-146b 和mmu-miR-379的表達水平上調以及mmu-miR-122、mmu-miR-133b、mmu-miR-1、mmu-miR-30a*、mmumiR-192和mmu-miR-203的表達水平下調，而且基因本體論分析發現，mmu-miR-142-3p、mmu-miR-142-5p等調控的靶基因參與脂肪細胞的分化，高脂飲食可以引起肥胖過程中脂肪組織中miRNA表達的改變，作者推測miRNA在肥胖過程中起調控作用。Romao等［43］研究了miRNA對牛脂肪組織的影響。當赫里福德亞伯丁安格斯牛生長到15.5月齡時收集其皮下脂肪和內臟脂肪，采用miRNA芯片檢測發現，在兩種脂肪組織中共有207個miRNA表達，其中37個具有組織特異性，而在兩種不同飲食中共同表達的miRNAs有169個，其中75個miRNAs具有飲食特異性。進一步RT-qPCR分析證實，受飲食影響的miRNAs有miR-19a、miR-92a、miR-92b、miR-101、miR-103、miR-106、miR-142-5p和miR-296，受脂肪組織影響的有miR-196a和miR-2454，靶基因預測及功能分析顯示差異表達miRNA調控的靶基因參與體液新陳代謝和脂肪細胞的分化。研究表明miRNA的表達受到飲食中脂肪的含量和脂肪組織類型的影響，miRNA可能在牛脂肪形成的調控過程中發揮作用。

Jorde等［44］選擇10名男性受試者，分為2組，每周給予40.0 IU維生素D3，時間為1年。給藥前后經RT-qPCR檢測發現第1組血清中有136個miRNAs，并且11個miRNAs表達差異有統計學意義;第2組中發現113個miRNAs，兩組中差異表達的miRNAs共有18個。隨后又選擇37名受試者作為安慰劑對照組，40名受試者服用高劑量的維生素D3，研究發現在給藥前檢測的血清中25-羥基維生素D與miR-532-3p表達之間有較大的相關性，并且給藥前后的對照組以及實驗組與對照組之間miR-221的表達差異有統計學意義，表明維生素D可能對血清miRNA的表達譜產生影響。

在人群資料研究中，發現miR-149 rs2292832的單核苷酸多態性與煤工塵肺發生的易感性有關，氡可引起miR-34a/b表達出現異常，可能是輻射損傷的早期標記，高脂飲食可以引起肥胖過程中脂肪組織中miRNA表達的改變，維生素D可能對血清miRNA的表達譜產生影響，因此，miRNA在人群研究中有很重要的意義。

3 展 望

miRNA的發現以及研究的快速發展為預防醫學的發展提供了前所未有的機遇。人類對miRNA的研究在預防醫學領域已取得一些進展，特別是毒理學中通過檢測外源化學物致靶組織miRNA表達譜的變化，有助于早期識別受試物的危險性，對于闡明其毒性機制，提高毒理學安全評估的效能具有很強的指導和現實意義。預防醫學是以人群為研究對象，miRNA的人群流行病學調查資料將使人們對環境化學物質暴露與人體健康之間的關系產生新的認識，然而目前國內外對miRNA的研究仍集中于體內和體外實驗，人群研究資料相對較少，這是今后miRNA在預防醫學領域研究的一個發展方向。現階段主要的工作仍然是不斷發現新的miRNA并弄清其功能和作用機制，相信隨著研究的深入，miRNA基因調控的功能和作用機制以及人群研究將在預防醫學領域給人類帶來更多的福音。

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