Tag SNPs在鑒定腫瘤易感性基因研究中的應用

吳華彰，樊紅，2

(1.東南大學生命科學研究院發育與疾病相關基因教育部重點實驗室，江蘇南京 210009;2.東南大學醫學院 遺傳與發育生物學系，江蘇 南京 210009)

腫瘤是一類由遺傳與環境因素共同作用導致的復雜疾病，對腫瘤易感基因的研究一直是分子腫瘤學領域的熱點。隨著全基因組連鎖分析方法［1］的應用，很多單基因遺傳疾病的易感基因被鑒定出來，然而對腫瘤等多基因疾病的研究卻受到了極大的限制，于是人們開始把注意力轉向以單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)為分子標記、以全基因組內SNP和連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)為基礎的全基因組關聯分析(genome-wide association studies，GWAS)上［2］。因此，如何選擇候選 SNPs已成為關聯分析的關鍵。

由于SNP位點間存在LD現象，只需從SNPs位點集合中篩選出少量標簽SNP(Tag SNPs)位點集合，就可以提供全體SNPs位點的遺傳模式信息。將Tag SNPs應用于腫瘤等復雜性疾病的關聯分析，可以極大地減少遺傳分型的費用，提高關聯分析的效率。如何有效地預測和利用Tag SNPs已經是腫瘤易感性領域研究的關鍵所在。

1 候選Tag SNPs的獲取及分析

1.1 Tag SNPs與單體型

一條染色體上或某一染色體區域的一組關聯性SNPs位點被稱作單體型(haplotype)。由于SNPs位點間存在著LD，所以只要用少數幾個SNPs即可特異性地鑒定出該連鎖群的單體型，這種SNP常被稱為Tag SNP，又稱單體型 Tag SNP(haplotype-tag SNP，ht SNP)。通過對單體型圖中大約50萬個Tag SNP的掃描就可達到與全基因組掃描1 000萬個SNP同樣的效果，使利用全基因組掃描尋找致病基因或疾病相關基因變得更為高效、全面和經濟。

1.2 候選Tag SNPs的獲取方法

目前，關于Tag SNPs位點的獲取方法主要有3類。基于LD選擇方法是根據SNP位點間LD的原理，選擇與其它SNP位點間具有較高LD值的SNP作為Tag SNP，將鄰近區域內具有高LD值(r2≥0.8)的SNP位點組成一個 LD簇，以 r2最大者為該單倍域(haplotype block)的 Tag SNP［3］。基于單體型域的選擇方法最早由Patil等［4］提出，是根據人類單體型數量遠少于理論數量的原理，將基因組序列數據劃分為多個離散的單體型域，在這些域中找出能夠區分各單體型域中單體型的最小SNP位點集作為Tag SNPs。Tag SNPs獲取的另一種方法是Halldorsson等［5］提出的基于預測精度的Tag SNPs選擇方法，即定義Tag SNPs為一個有限的特定SNP位點集合，該集合能夠重構剩余的SNP位點(被標記位點，Tagged SNP)。基于以上原理，一些用于篩選Tag SNPs的軟件陸續開發出來。如通過Haploview軟件篩選Tag SNP;Seattle SNP不僅提供了部分Tag SNP信息，同時還提供了Tag SNP的選擇工具perl軟件。此外，可利用的公開的網上資源包括Genome Variantion Server(http:∥gvs.gs.washington.edu/GVS/)和National Institute of Environmental Health Sciences(http:∥snpinfo.niehs.nih.gov/)，他們利用計算、實驗、流行病學資料及GWAS、LD的結果和SNP功能預測信息篩選 Tag SNP。另外，HapMap數據庫(http:∥snp.cshl.org/)、NCBI SNP 數據庫(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)、美國 NIH 的癌癥和腫瘤相關候選 SNP 數據庫(http:∥ipg.nci.nih.gov/)、歐洲SNP 數據庫(http:∥www.gwascentral.org/index)、日本SNP 數據庫(http:∥snp.ims.u-tokyo.ac.jp)、人類基因突變數據庫 HGMD(http:∥www.hgmd.cf.no.uk/)、華盛頓大學 SNP 數據庫(http:∥ibc.wustl.edu/snp)、美國懷特和特研究所建立的人類SNP數據庫(http:∥www.genome.wi.nit.edu/SNP/human/index.html)、瑞典卡爾林斯卡研究院建立的數據庫(http:∥hgbase.cgr.ki.se)等都提供了豐富的 SNP信息。

1.3 Tag SNPs檢測方法

Tag SNPs的檢測方法一類是以凝膠電泳為基礎的經典方法，包括PCR-SSCP、PCR-RFLP、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、等位基因特異性PCR(ASPCR)等;另一類是近些年來陸續發展起來的高通量、高自動化的檢測方法，包括TaqMan探針技術、DNA芯片檢測、變性高效液相色譜、DNA測序法、基質輔助激光解吸附/電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)檢測及根據高分辨率溶解曲線(HRM)進行分型檢測等。

2 Tag SNPs在腫瘤易感性研究中的應用

目前，腫瘤發生相關SNPs研究集中于重要的癌基因、抑癌基因、關鍵信號轉導通路基因及一些重要功能基因中的單個或者多個SNP位點。腫瘤易感性的關聯研究經歷了候選基因(candidate gene)策略、候選生物學通路(candidate biological pathway)策略和GWAS策略3種重要的SNPs候選策略。

2.1 Tag SNPs在基于候選基因策略中的應用

候選基因法是選擇已知在腫瘤發生、發展過程如細胞周期控制、凋亡、DNA修復通路以及致癌物代謝中的關鍵基因，或腫瘤中明確存在體細胞突變的基因作為候選基因，運用單倍型構建Tag SNPs，通過病例-對照研究找出腫瘤易感基因。Wassenaar等［6］運用Tag SNPs研究了尼古丁代謝的CYP2A6基因和尼古丁基因簇CHRNA5-CHRNA3-CHRNB4(CHRNA5-A3-B4)，證實其多態性可增加肺癌風險;Schonfeld等［7］通過病例-對照研究從58個候選基因的1 151個Tag SNPs鑒定出CYP19A1基因的4個SNPs與乳頭狀甲狀腺癌相關;Wang等［8］從 HapMap、dbSNPs數據庫和文獻中篩選出XPF、MDM2基因的Tag SNPs，發現XPF基因啟動子區-357A＞C多態變異通過影響XPF基因的轉錄調控，干擾膀胱癌的遺傳易感性和預后，位于MDM2啟動子區的-1797C＞G多態與膀胱癌的發病風險有關。以上這些多人群、多中心、大樣本甚至利用HapMap進行候選基因單體型的研究，對定位腫瘤易感基因進行了有益而可靠的探索。

候選基因法因為有生物學基礎，所以在鑒定腫瘤候選基因時成功幾率大、結果易解釋、成本低廉。但是，該方法是在對候選基因充分認識的基礎上提出的假說，因此，可能錯過其它與疾病真正相關的位點。另外，未發現陽性關聯并不排除同一基因中還存在其他重要Tag SNPs，與疾病關聯的Tag SNPs也不一定就是有功能的遺傳變異，這時就要進行功能研究以證實哪個是致病性或功能性SNP。

2.2 Tag SNPs在候選生物學通路策略中的應用

腫瘤的發生通常由細胞內多種生物學通路的紊亂所致，因此，基于某些重要的候選生物學通路研究策略應運而生。涉及到的通路包括DNA損傷修復通路、JAK-STAT通路、EGF受體信號轉導通路、細胞周期和凋亡等通路、葉酸代謝通路等。Zhang等［9］研究發現，TGF-β1-509C＞T多態是影響結直腸癌易感性主要的多態位點，它和LTBP-1L GA/CC多態位點都可以顯著增加結直腸癌的患病風險;MAPK信號通路中的關鍵基因MKK4啟動子遺傳變異-1304T＞G與中國南方人群肺癌的高發相關［10］，T＞G的置換可明顯增加MKK4基因的轉錄水平;DNA損傷修復通路關鍵基因XRCC1的Arg194Trp和Arg280His多態能夠增加膀胱癌的發病風險［11］;凋亡通路中的FASL-844T＞C多態能夠使個體罹患膀胱癌的風險增加［12］;IGF2基因SNPs與上皮性卵巢癌相關聯［13］，而VD通路的變異可能是非洲血統婦女雌激素受體陰性乳腺癌高發的原因［14］。

候選生物學通路法可以彌補候選基因法缺乏廣泛性和系統性的缺點，且具有明確的生物學機制，在鑒定腫瘤易感基因及分析基因聯合作用等方面具有預測精度高、假陽性較低等顯著優勢，已經取得了較多的研究成果，但是研究設計需要較大的樣本量，也需要根據現有的生物學通路提出假說。

2.3 Tag SNPs在GWAS策略中的應用

隨著人類基因組計劃及單體型圖譜構建的完成和高通量基因分型技術的快速發展，人們開始采用GWAS策略對腫瘤致病基因位點進行挖掘。GWAS［15］是根據LD的原理，選擇數以十萬計的Tag SNPs以涵蓋人類全基因組范圍的遺傳變異，比較病例-對照組多態位點的頻率差異來尋找全基因組中與疾病相關的易感基因，是目前搜尋腫瘤等復雜疾病易感基因的最有效方法。Amos等［16］通過選取315 450個Tag SNPs位點對肺癌進行GWAS研究，從而把肺癌的易感基因定位于15q25.1。乳腺癌GWAS結果發現了 FGFR2(rs2981582)、TNRC9/LOC643714(rsl2443621)、MAP3KI(rs889312)和 LSPl(rs3817198)、8q24的 rsl3281615等5個乳腺癌的易感位點［17］，為深入理解乳腺癌的發病機制提供了新線索，為乳腺癌高危人群的篩選和個性化預防和治療開辟了新思路;英國學者通過GWAS驗證了SMAD7基因與結直腸癌的關聯性［18］，對結直腸癌病理分期和預后判斷有一定意義。Cui等［19］報道了日本人群中食管癌的GWAS結果，隨后中美學者［20-21］陸續發表了食管癌的GWAS研究成果。至今，研究人員已經對400余種復雜疾病開展了近1 500項GWAS研究，發現了一大批易感基因或位點，其中近300項研究成果發表在 New Engl J Med、Science、Nature和 Nat Genet等國際頂級學術刊物上［22］。

選擇基因組中的Tag SNPs進行GWAS研究大大減少了工作量，但是不能完全捕獲全部基因組的SNP變異。另外，GWAS的結果存在假陽性、假陰性、檢測到的單核苷酸多態性很少位于功能區以及對稀有變異不敏感等問題，導致了其應用的局限性［23］。正如Nancy Cox教授所說:“GWAS研究的結果到臨床應用的路上仍然布滿荊棘”［24］。

3 結語與展望

選擇和使用Tag SNPs極大地促進了在基因組水平范圍內確定腫瘤易感基因，對腫瘤高危人群的篩選、危險度評價及預警、輔助分子診斷、腫瘤的治療、預后判斷及腫瘤藥物的開發等都具有重大意義。目前，利用Tag SNPs進行關聯分析已經鑒定出包括乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等一系列腫瘤的易感基因。但是，基于Tag SNPs的關聯研究也存在諸如Tag SNPs位點選取存在復雜度高、限制條件多、精確度低等缺陷，進而導致假陽性、假陰性等問題。同時，腫瘤具有遺傳異質性，存在種族差異，一個Tag SNPs并不能完全解釋某些腫瘤發生的原因。此外，相當一部分Tag SNPs被證實在基因組的非編碼區，從非功能性Tag SNPs中找出功能性將是一項更大的挑戰［25］。所以，在選取Tag SNPs時盡可能結合多個軟件和采用多種方法，對關聯程度高的位點進行多種族、多群體、大樣本的重復驗證研究，并進一步利用細胞或動物模型進行證實，將有助于明確基因在腫瘤發生中的作用。可喜的是，隨著功能基因組研究的深入，原來的研究方法不僅得以補充和發展，一些新的如外顯子測序策略［26］、系統生物學策略等陸續出現，腫瘤易感性研究必將迎來一個更加廣闊的發展空間。

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