內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與腫瘤

金學英，汪步海

(揚州大學醫(yī)學院蘇北人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇揚州 225001)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)Ca2+存儲和蛋白質(zhì)合成的主要場所，多種刺激(如營養(yǎng)匱乏、乏氧、酸中毒等)可致細胞內(nèi)Ca2+平衡紊亂或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)堆積，從而導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的發(fā)生。ERS主要包括以下3種反應［1］:未折疊蛋白反應(unfolded protein reactive，UPR)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負荷反應(endoplasmic reticulum overload response，EOR)和固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應。UPR和EOR是蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積所引起，而固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的膽固醇損耗所致。目前研究表明，ERS中UPR和EOR可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移及預后密切相關。

1 ERS中的信號轉導通路

1.1 UPR中的信號轉導通路

ERS時UPR對細胞主要起保護作用，目前已知的哺乳動物體內(nèi)UPR有3條轉導通路:雙鏈RNA激活的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR like ER kinase，PERK)信號轉導通路、需肌醇酶1(type-I endoplasmic reticulum transmembrane protein kinase，IRE1)信號轉導通路和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)信號轉導通路［2］。當細胞處于正常狀態(tài)時，PERK、IRE1和ATF6與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucoseregulated protein78，GRP78)結合而失活，ERS時GRP78與未/錯誤折疊蛋白結合，PERK、IRE1和ATF6與GRP78解離而激活引起下游元件的激活進而介導細胞生存與凋亡，但PERK、IRE1和ATF6上游激活機制目前尚不明了。

PERK信號轉導通路:ERS過程中，激活的PERK使真核翻譯起始因子-2的α亞基(eukaryotic translation initiation factor-2 alpha subunit，eIF2α)51 位的絲氨酸磷酸化而失活，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大部分蛋白質(zhì)的合成，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的堆積，但少數(shù)與應激相關的基因如ATF4卻表達上調(diào)。激活的ATF4使與凋亡有關的C/ERB同源蛋白質(zhì)(C/ERB homologous protein，CHOP)/生長抑制和 DNA損傷基因(growth arrest and DNA damage gene，GADD153)的轉錄上調(diào)，從而誘導細胞凋亡［3］。

IRE1信號轉導通路:IRE1是發(fā)現(xiàn)最早也最重要的調(diào)節(jié)蛋白，具有抗凋亡和促凋亡的雙重作用［4］，主要表現(xiàn)在以下三方面:(一)活化的IRE1通過其核酸內(nèi)切酶活性剪切去除X盒結合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP-1)mRNA的26個內(nèi)含子，使其成為成熟的mRNA，進而翻譯出大量XBP-1蛋白。XBP-1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應元件(endoplasmic reticulum stress response element，ERSE)結合，誘導 GRP78 和CHOP 基因表達進而誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甘露糖苷酶樣蛋白(endoplasmic reticulum mannosidase-like protein，EDEM)的表達，增加錯誤折疊蛋白的降解，促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的恢復。(二)活化的IRE1激活凋亡信號調(diào)節(jié)激酶 1(apoptosis signalregulating kinase 1，ASK1)及其下游靶基因氨基末端激酶(jun N-terminal kinase，JNK)和核轉錄因子(nuclear factor kappaB，NF-κB)，磷酸化的JNK通過激活促凋亡因子bcl-2介導的細胞凋亡(Bcl-2 interactingmediator of cell death，BIM)并抑制抗凋亡因子B細胞淋巴瘤/白血病2(B cell leukemia-2，bcl-2)促進細胞凋亡，而 NF-κB主要表現(xiàn)為促進bcl-xl，腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF)、凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)等抗凋亡蛋白的轉錄抑制細胞凋亡蛋白caspase家族成員的轉錄激活，從而抑制細胞凋亡。(三)活化的IRE1通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的Caspase-12凋亡通路促進細胞凋亡［5］。

ATF6信號轉導通路:解離的ATF6向高爾基體轉位，被核內(nèi)切酶片段1(site-1 protease，S1P)和核內(nèi)切酶片段2(site-2 protease，S2P)剪切激活后進入細胞核內(nèi)，激活的ATF6可以上調(diào)與蛋白質(zhì)和脂類合成相關的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導基因的表達。在哺乳動物中，UPR的啟動依賴于ATF6的激活，激活的ATF6結合UPR靶基因的順式作用元件ERSE，上調(diào)其下游基因如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78的轉錄，促進蛋白質(zhì)的折疊［6］。同時與非折疊蛋白反應元件及ERSRⅡ結合，誘導包括CHOP在內(nèi)的基因表達，介導細胞凋亡。

1.2 EOR中的信號轉導通路

在ERS反應過程中，大量糖蛋白沉積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引起EOR、EOR和UPR相對獨立但又存在共同的信號通路。Eike等［7］報道，EOR時細胞內(nèi) Ca2+平衡紊亂導致細胞內(nèi)大量的活性氧片段(reactive oxygen species fragment，ROS)產(chǎn)生，激活炎癥因子 NF-κB。有研究人員［8］的研究表明，IRE1在 EOR中處于中心地位，與GRP78解離后，磷酸化的IRE1聚集腫瘤壞死因子受體相關因子2(tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF2)而激活系列免疫相關激酶，以ASK1最為重要，形成IRE1/TRAF2/ASK1復合體，級聯(lián)激活JNK及NF-κB，誘導細胞發(fā)生抗凋亡反應。此外，Chen等［9］的研究表明，EOR可以促進GRP78的表達上調(diào)及caspase-12的激活。

2 ERS與腫瘤的發(fā)生

有文獻［10］報道超過15%腫瘤的發(fā)生與慢性炎癥相關，如胃癌可繼發(fā)于Hp感染［11］、宮頸癌常繼發(fā)于HPV16-18 感染［12］、肝癌常繼發(fā)于慢性乙型肝炎［13］等。同時有文獻［14］報道，在不同類型的腫瘤細胞中都存在ERS。

炎癥和ERS之間存在一定聯(lián)系。近期研究［15］表明，在腫瘤細胞和骨髓基質(zhì)干細胞中ERS與促炎癥因子NF-κB的轉錄激活相關。一方面，EOR時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未/錯誤折疊蛋白的堆積導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中漏出，引起線粒體中Ca2+的積聚進而導致線粒體內(nèi)膜去極化，中斷呼吸鏈中電子的轉移，導致ROS的產(chǎn)生并介導NF-κB的激活;另一方面，ERS通過PERK和IRE1α轉導通路的激活介導NF-κB的激活，進而激活蛋白激酶JNK。激活的NF-κB主要表現(xiàn)為三方面的作用［16］:(1)NF-κB和JNK的激活是引起炎癥反應的關鍵因素，啟動包括COX-2的促炎癥因子的基因轉錄，促進炎癥反應的發(fā)生。(2)促進包括 bcl-xl、TRAF、IAP在內(nèi)的抗凋亡蛋白的轉錄，抑制caspase家族成員的轉錄激活。(3)增強細胞周期蛋白cyclinD1的表達，促進細胞周期中G1/S、G2/M之間的轉化，從而促進細胞生長。Deeb等［17］的研究表明，在前列腺癌中PERK通過激活的NF-κB顯著上調(diào)抗凋亡bcl-2、bcl-xl、cIAPI和生存素survivin的表達而促進腫瘤的發(fā)生。Li等［18］的研究表明，在長期持續(xù)暴露于砒霜的SKH-1大鼠模型中，砒霜通過介導PERK和IRE1α的磷酸化激活NF-κB，進而誘發(fā)暴露于砒霜的皮膚發(fā)生癌前病變(黑角病和角質(zhì)化)，并可能發(fā)展為基底細胞癌和鱗狀細胞癌。

腫瘤的發(fā)生是遺傳、環(huán)境和基因突變等多因素作用的結果，在腫瘤細胞中凋亡與抗凋亡的失衡導致腫瘤細胞的無限增殖。NF-κB的激活可以通過其抗凋亡作用介導細胞周期蛋白的表達而促進細胞的生長，可能在腫瘤形成的過程中起重要的作用。

3 ERS與腫瘤細胞的凋亡

ERS通過多種途徑介導細胞凋亡反應，包括ERS引起的凋亡反應和與NF-κB介導的抗凋亡反應。ERS引起細胞凋亡主要有3種途徑:CHOP/GADD153通路、JNK通路、ER特有的Caspase-12通路。從ERS到凋亡典型的通路是PERK/eIF2α下游的轉錄因子GADD153/CHOP的表達。當ERS持久存在時，激活的PERK通過eIF2α磷酸化使ATF4表達上調(diào)，誘導促凋亡因子CHOP/GADD153的表達促進細胞凋亡。激活的IRE1和ATF6，其胞漿部分進入核內(nèi)，與ERSE保守基序列 CCAAT(N9)GCACG中的 GCACG相連，CCAAT被NF-Y占據(jù)，啟動CHOP/GADD153轉錄與表達，通過抑制抗凋亡基因bcl-2的表達上調(diào)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化損傷。Fujiwara等［19］通過對荷爾蒙抗拒的前列腺癌細胞DU145和PC3細胞的研究表明，利用siRNA干擾技術下調(diào)促凋亡因子CHOP/GADD153的表達可引起細胞凋亡。此外，IRE1信號通路可通過介導JNK的激活和Caspase-12的激活促進細胞凋亡。在非ERS時IRE1/TRAF2/Precaspase-12形成復合物，ERS時Precaspase-12與TRAF2分離而引起Caspase-12的激活，Caspase-12活化后誘導GRP78、GRP94等分子伴侶產(chǎn)生增加并級聯(lián)激活Caspase-9、Caspase-3和caspase-7等效應分子，caspase-3，7，9通過線粒體途徑和死亡受體途徑誘導凋亡的發(fā)生［20］。而有相關文獻［21］報道caspase-12僅存在于鋸齒動物中，在人類，caspase-4起caspase-12的作用。Wu等［22］在食管癌細胞EC109中首次證實，腺苷可以通過 CHOP和caspase-4通路誘導食管癌細胞凋亡。

NF-κB抗凋亡作用主要表現(xiàn)在:激活的NF-κB通過上調(diào)C-IAP1、C-IAP2和生成素survivin等的表達抑制caspase的凋亡通路。一方面上調(diào)的C-IAP1和CIAP2通過與Caspase-9前體結合抑制其激活進而阻止Caspase-3前體的激活，阻斷Caspase級聯(lián)反應引起的細胞凋亡。另一方面上調(diào)的Survivin可以作用于細胞周期依賴性蛋白激酶CDK4，形成survivin/CDK4復合物，使P21從P21/CDK4復合物中釋放出來，解離的P21蛋白對細胞周期抑制作用消失并作用于Caspase-3前體，形成Procaspase-3/P21復合物，抑制Caspase-3激活引起的凋亡［23］。此外，激活的NF-κB與bcl-2上特異性的NF-κB的結合位點結合，通過轉錄途徑直接上調(diào)bcl-2表達阻止細胞凋亡。Hoffmann等［24］的研究表明，在高表達抗凋亡因子Bcl-2的Jurkat細胞系、乳腺癌細胞MCF-7和胰腺癌細胞L63PC，NF-κB抑制劑錦雞素可以通過抑制NF-κB的表達從而克服Bcl-2誘導的治療抵抗。ERS通過促進促凋亡反應誘導腫瘤細胞的凋亡，通過抗凋亡反應導致細胞的無限增殖，促進腫瘤細胞在不利微環(huán)境中的生存。

4 ERS與腫瘤新生血管生成

ERS時UPR可以影響血管因子的表達促進腫瘤新生血管的形成，Wang等［25］研究表明，由葡萄糖缺乏引起的UPR可以上調(diào)促血管生成因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、FGF2和IL6的表達并下調(diào)血管生成抑制因子 THBS1、CXCL14和 CXCL10的表達。其中VEGF是針對內(nèi)皮細胞特異性最高，促血管生長作用最強的有絲分裂原。Ghosh等［26］的研究表明，ERS時IRE1α-XBP1、PERK-ATF4和 ATF6α分別直接作用于VEGF基因的不同區(qū)域獨立調(diào)節(jié)VEGFA mRMA的表達。其中，PERK-ATF4途徑中 ATF4直接結合到VEGFA基因的第1個內(nèi)含子促進VEGFA的表達，而ATF6則通過與促VEGFA受體結合促進VEGFA的表達。在肝癌細胞中通過siRNA技術分別沉默IRE1α-XBP1、PERK-ATF4和 ATF6α 的表達，均可降低VEGFA的表達及腫瘤細胞血管的生成，而這一作用與乏氧誘導因子的表達無關。

據(jù)報道［27］，VEGF在多種腫瘤細胞中高表達，不僅是關鍵的血管形成刺激因子，同時對腫瘤的侵襲和轉移起重要作用。Auf等［28］在對膠質(zhì)瘤細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制IRE1的表達可以減少腫瘤細胞新生血管形成、降低腫瘤的生長速率并增加腫瘤細胞的侵襲性。此外，激活的NF-κB可以通過上調(diào)環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase2，COX-2)的表達促進腫瘤新生血管的生成。Manu等［29］研究表明，γ-生育三稀酸通過抑制NF-κB引起COX-2的上調(diào)，減少胃癌細胞的新生血管形成以及對卡陪他濱的化療抵抗。

5 ERS分子伴侶GRP78與腫瘤的關系

GRP78在多種腫瘤細胞中高表達，通過激活UPR信號轉導通路影響腫瘤的生存和發(fā)展。激活的轉錄因子ATF6和ATF4通過上調(diào)GRP78的表達，促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的正確折疊［30］。Fasano 等［31］研究表明，降低GPR78的表達可以顯著增強二十二碳六烯酸(DHA)誘導結腸癌細胞系HT-29、HCT116和SW480的凋亡作用。Martin等［32］對黑色素瘤細胞CHL-1和WM266-4細胞的研究表明，通過RNAi干擾技術抑制GRP78的表達可以抑制芬維A酸誘導的腫瘤細胞的凋亡。另外，GPR78的高表達與腫瘤的預后不良及腫瘤的治療抵抗相關。通過對乳腺癌患者的回顧性研究發(fā)現(xiàn)［33］，GRP78和 IRE1α 在乳腺癌患者中的表達分別高達70%和90%，而GPR78的高表達可以縮短腫瘤復發(fā)的時間。Huang等［34］研究證實，降低GRP78的表達可以增強塞來考昔在泌尿道上皮細胞腫瘤中的細胞毒性，降低腫瘤的抗藥性。然而Adrienne等［35］研究表明，過表達的GR78可以與PERK、ATF6、IRE1結合使其失活，抑制UPR反應通路，對UPR起負反饋調(diào)節(jié)作用。

6 結 語

ERS在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中普遍存在，對細胞的生存具有雙向調(diào)節(jié)作用，既可以對細胞起保護作用，又可以誘發(fā)腫瘤的發(fā)生并促進腫瘤細胞的生存、發(fā)展、新生血管生成及治療抗拒性。通過抑制ERS信號轉導通路中某種基因或蛋白的表達從而抑制腫瘤細胞的生長，成為腫瘤治療的分子靶點。

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