氨基多糖含量測定方法的研究

● 山西省產品質量監督檢驗研究院 賈亮 中北大學材料學院 范平

氨基多糖用途十分廣泛，食品工業及醫藥界將其稱為“ 第六要素”。其廣泛應用于醫療、生物技術、化妝品、水處理、造紙、食品工程等領域。氨基多糖含量的測定也成為重要的課題，現今其測定方法有很多種，如乙酰丙酮法、USP 法、HPLC 衍生化法、紫外分光光度法(UV 法)、硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法等。但都有其各自的特點，找出一種最佳測定氨基多糖的方法具有重要意義。

實驗部分

1.實驗試劑與藥品

實驗所需主要試劑如表1所示

表1 實驗試劑與藥品

2.實驗儀器

UV—754 型紫外分光光度計。

3.硫酸苯酚法

（1）實驗原理

苯酚法測定可溶性糖的原理是：糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10 mg～100 mg 范圍內其顏色深淺與糖的含量成正比，且在490 nm 波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。

（2）標準曲線的制備

準確稱取對照品100 mg，制成2.00 mg/mL 溶液于50 mL 容量瓶中備用。然后分別準確稱量，取上述溶液2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL 于50 mL 容量瓶中，加水至刻度（相當于制備0.08 mg/mL、0.12 mg/mL、0.16 mg/mL、0.20 mg/mL、0.24 mg/mL 的濃度），分別吸取上述溶液各2.0 mL，再加苯酚試劑1.0 mL，搖勻，緩慢滴加濃硫酸5 mL，搖勻后放置5 min，置于沸水浴中加熱15 min，然后冷卻至室溫，用分光光度計在490 nm處，水作參比測定各溶液的吸光值。以吸光值為縱坐標、濃度為橫坐標、繪制標準曲線，求回歸方程。

（3）測定

取樣品1 g（試樣），稱準至0.0001 g。用水溶解后移入25 mL的容量瓶中，加水稀釋至刻度。以下操作按本法“標準曲線的制備”中分別吸取上述溶液2.0 mL……規定執行。

（4）回收率的計算

吸取試品溶液0.5 mL，分別加入標準葡萄糖溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，且分別置于25 mL 試管中，補水至2 mL，以下操作按“標準曲線的制備”中加入6%苯酚1.0 mL……規定執行。

4.硫酸蒽酮法

（1）實驗原理

糖在濃硫酸作用下，可經脫水反應生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應生成藍綠色糠醛衍生物，在一定范圍內，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量。

（2）標準曲線的制備

精密量取對照品溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分別置于25 mL 量瓶中，用蒸餾水定容、搖勻，分別精密量取0.5 mL，加4 mL 濃硫酸，搖勻，5 min后加1 mL 顯色劑，搖勻。置于100 ℃水浴加熱10 min，取出，速冷至室溫后，以0 mL 對照品溶液制備為空白試劑，以600 nm 為測定波長測定各濃度的吸光值。以吸光值為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程。

（3）測定

取樣品1 g（試樣），稱準至0.0001 g。用水溶解后移入25 mL 的容量瓶中，加水稀釋至刻度。以下操作按本法“標準曲線的制備”中分別吸取上述溶液0.5 mL……規定執行。

（4）回收率的計算

吸取試品溶液0.5 mL，分別各加入標準葡萄糖溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別置于25 mL 試管中，補水至2 mL，以下操作按本法“標準曲線的制備”中分別吸取上述溶液0.5 mL……規定執行。

5.乙酰丙酮法

（1）實驗原理

氨基葡萄糖在堿性條件下加熱，乙酰丙酮將氨基葡萄糖分子2 號碳位上的氨基乙?；蓭в羞量┉h的N- 乙酰衍生物。該衍生物與對二甲氨基苯甲醛反應，反應物呈紅色，于525 nm 處測定吸光度。其適用范圍是氨基糖。

（2）標準曲線的制備

分別精密量取100 mg/mL 標準品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL 置于20 mL 比色管中，另取試品溶液5 mL 置于25 mL 比色管中。各加水至5 mL，再另取25 mL 比色管一支，加水5 mL 作為空白。各加乙酰丙酮試劑1.0 mL，搖勻，置沸水浴中準確加熱25 min，取出，用冰水浴迅速冷卻后，加無醛乙醇3.0 mL，在60 ℃水浴中保溫10 min 后，再加對二甲氨基苯甲醛試液1.0 mL，強力振搖，并繼續在60 ℃水浴中保溫1 h，立即用冷水冷卻至室溫，用分光光度計在525 nm 處，水作參比測定各溶液的吸光值。計算即得供測試樣濃度。以吸光值為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程。

（3）測定

取樣品1 g（試樣），稱準至0.0001 g。用水溶解后移入25 mL的容量瓶中，加水稀釋至刻度。以下操作按本法“標準曲線的制備”中各加乙酰丙酮試劑1.0 mL，搖勻……規定執行。

（4）回收率的計算

吸取試品溶液0.5 mL，分別各加入標準葡萄糖溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別置于25 mL 試管中，補水至2 mL，以下操作按本法“標準曲線的制備”中各加乙酰丙酮試劑1.0 mL……規定執行。

結果分析與討論

1.硫酸苯酚法標準曲線

硫酸苯酚法標準曲線如圖1所示：

其回歸方程為y = 2.4297x + 0.0098，多次測得被測試樣的吸光值平均值為0.416，對照曲線得其平均濃度為0.167 mg/mL，其回收率為97.7%。

2.硫酸蒽酮法標準曲線

硫酸蒽酮法標準曲線如圖2所示：

其回歸線方程為y=4.1037x- 0.0093，多次測得被測試樣的平均吸光值為0.765，對照曲線得其平均濃度為0.186 mg/mL，其回收率為96.5%。

3.乙酰丙酮法標準曲線

乙酰丙酮法標準曲線如圖3所示：

其回歸線方程為y=1.0771x- 0.0011，經多次測得被測試樣的平均吸光值為0.176，對照曲線得其平均濃度為0.170 mg/mL，其回收率為95.8%。

4.討論

（1）對所得數據的討論

硫酸苯酚法所測得的羥氨基葡聚多糖（鈉型）含量最小，乙酰丙酮法所測得的含量居中，而硫酸蒽酮法所測得的含量最大。苯酚硫酸法方法簡單、靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質存在的影響，并且產生的顏色穩定160 min 以上。蒽酮- 硫酸法幾乎可以測定所有的碳水化合物，所以用該法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。因此，蒽酮硫酸法測定結果偏高于苯酚硫酸法。而乙酰丙酮法所測得的結果穩定性較好，顯色在10 min～30 min 內，穩定性較好。

（2）試劑的比較

硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法所用的硫酸均為分析純，如果不用分析純則空白大。乙酰丙酮法中，要用到無醛乙醇，主要是由于乙酰丙酮是測定甲醛含量的主要試劑，如果乙醇中含有醛基則影響測定結果，但是無醛乙醇的制備需要很長的時間，影響實驗的效率。而硫酸苯酚法以及硫酸蒽酮法所用到的試劑都容易制備。蒽酮試劑易氧化、遇水后測定數值波動較大，且幾乎可以測定所有的碳水化合物，所以用該法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。硫酸苯酚法的回收率：結果顯示平均回收率是97.7%。在3 種實驗方法中最高。

（3）試驗方法的比較

表2 各種方法的比較

結論

本實驗所用的3 種方法中，硫酸蒽酮法所測結果數值偏大，穩定性最差，不是測定氨基多糖含量的最佳方法。而乙酰丙酮法測量數值較為準確，穩定性也比較好，但實驗所需的無醛乙醇的制備較為復雜，使得該方法操作繁瑣。硫酸苯酚法方法簡單、靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質存在的影響，并且產生的顏色穩定160 min以上，是最佳的測定氨基多糖含量的方法。