等離子體降解黃曲霉毒素B1的試驗研究

張 巖 董曉娜 姜文利 王世清

（青島農業大學食品科學與工程學院1，青島 266109）

（青島市現代農業質量與安全工程重點實驗室2，青島 266109）

黃曲霉毒素（Aflatoxins，簡稱AFT）具有極強的致癌性、致畸性和致突變性，在1993年即被WHO國際腫瘤研究機構劃定為Ⅰ類致癌物［1－2］。據FAO統計，世界上約有25%的糧食產品受到真菌毒素的污染，其中黃曲霉毒素是污染最嚴重的真菌毒素之一［3］。大豆、谷物、玉米、花生、調味品、奶制品、食用油等農產品中經常發現黃曲霉毒素，其中花生和玉米黃曲霉毒素污染最嚴重［4］。目前降解黃曲霉毒素常用的方法主要有二氧化氯浸泡法、生物法、輻照法等［5－10］，但化學法極易帶來新的有機溶劑殘留，生物法則由于成本和技術原因難以推廣，因此，本實驗擬研究一種基于物理處理——等離子體處理的新方法以替代傳統的化學、生物法。

等離子體技術自20世紀80年代已廣泛應用于醫學、軍事等領域［11－15］，Yamatake等［16］利用脈沖電暈放電處理含酚水溶液，在FeSO4存在條件下，1～2.4 mg／L苯酚溶液15 min后全部降解；Tezuka等［17］研究了等離子體降解水溶液中的苯酚、苯甲酸和氯苯，發現降解是由于等離子體和陽極液體界面產生OH自由基引起的；陳根生［18］等降解廢水中4－氯酚，證實其降解主要是放電產生氫氧自由基的結果；Patel等［19］發現同時使用過氧化氫和伽瑪射線照射可以更有效地降低AFT的毒性，4 kGy伽瑪射線和5%的過氧化氫可使100 pgAFT完全滅活。

等離子體技術應用領域雖然廣泛，但將其用于黃曲霉毒素降解的研究報道較少。為了考察和評價等離子體處理對黃曲霉毒素降解的影響效果，本文選用黃曲霉毒素B1為試驗材料，利用響應面分析法優化等離子體降解黃曲霉毒素的參數，以期為等離子體處理黃曲霉毒素的深入研究提供試驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

黃曲霉毒素B1（Clenbuterol）ELISA檢測試劑盒（96孔）：杭州天邁生物科技有限公司。

等離子發生器：美國Dressler公司生產；酶標儀：上海坤肯生物化工有限公司。

1.2 試驗裝置

試驗裝置由青島農業大學食品科學與工程學院自行設計研制，該裝置主要由射頻等離子發生器1、水冷卻器2、等離子發生倉4和真空泵8等組成，如圖1所示。等離子體發生倉4內設有等離子體電極3，工作時，將試驗物料7放入處理倉兩極之間，利用真空泵8將整個系統置于高真空狀態下，通過調節等離子發射器功率、兩極間距，控制作用時間等參數可對該設備的降解效果和機理進行系統的研究。

圖1 試驗裝置圖

1.3 試驗方法

選取對黃曲霉毒素B1降解有影響的3個主要因素：作用功率、作用時間和極距，根據 Box－Benhnken試驗設計原理，采用3因素3水平響應面分析方法進行試驗設計，以降解率為響應值（Y），進行影響因素的工藝優化試驗。

1.4 測試方法

樣品中黃曲霉毒素含量用黃曲霉毒素ELISA檢測試劑盒和酶標儀進行測定。本試驗使用的黃曲霉毒素B1ELISA試劑盒參考國家標準GB／T 5009.22—2003，能夠快速而準確的分析樣品中黃曲霉毒素B1殘留，且本試劑盒已廣泛應用于企業快速檢測，故使用此檢測方法較可靠。

1.4.1 溶液配制

洗滌工作液：用去離子水將濃縮洗滌液按1∶9體積比進行稀釋，用于酶標板的洗滌。

6個不同濃度的標準液：樣品取6個1.5 mL離心管，從1到6進行編號。取6個濃度的標準品50 μL分別加入以上6個管中，然后每管加入450μL去離子水進行 1∶9倍稀釋，制備成 0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1μg／kg的標準液。此系列溶液為毒素標準品系列溶液，由于標準品數量有限，配置濃度較低。試驗樣品先經稀釋再進行檢測，使樣品檢測值在標準曲線的線性范圍之內，樣品實際質量濃度高于20 μg／kg。

1.4.2 測試步驟

將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20～25℃）平衡30 min以上，每種液體試劑使用前均搖勻。

取出需要數量的微孔板，將暫時不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2～8℃。

將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在位置。

將處理后的樣品稀釋至5 mL，用移液槍取50 μL到對應的微孔中，再加入酶標物50μL／孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光環境中反應15 min。

揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液30 μL／孔，充分洗滌5次，每次間隔30 s，用吸水紙拍干。

加入顯色液100μL／孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光環境反應15 min。

加入終止液50μL／孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處測定每孔OD值。

1.4.3 標準曲線繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以黃曲霉毒素B1標準品濃度的對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。在0.1～8.1μg／kg范圍內，標準曲線擬合良好，其線性方程為：

Y＝－38.904x＋41.162，R2＝0.967 8

1.4.4 黃曲霉毒素B1降解率

本試驗結果以黃曲霉毒素B1降解率為評價指標，公式如下：

2 結果與分析

表1和表2分別為等離子體降解黃曲霉毒素影響因素的優化試驗結果及回歸分析。

表1 響應面試驗設計及數據處理

采用SAS RSREG程序對響應值與各因素進行回歸擬合后，得到以下回歸方程：

由表2可以看出，各因素中一次項X1、X2、二次項X12、X22是極顯著的，其次是一次項X3是顯著的，各試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，對黃曲霉毒素B1降解效果的影響順序（強→弱）：X1＞X2＞X3。由表2也可以看出，失擬檢驗不顯著，說明所建立的回歸方程擬合很好，試驗誤差不含其他不可忽略的因子對試驗結果影響。

表2 回歸分析結果

采用Design－Expert 7.0軟件對數據進行處理，考慮了因素間的交互效應關系，可得圖2～圖4。由圖2～圖4可知，作用功率對黃曲霉毒素B1降解率的影響最為顯著，表現為曲線較陡；作用時間次之，相

圖2 Z＝f（X1，X2）的響應面與等值線

應表現為曲線較為平緩；極距隨其數值的增加或減少，黃曲霉毒素B1降解率沒有顯著性變化。

圖3 Z＝f（X2，X3）的響應面與等值線

圖4 Z＝f（X1，X3）的響應面與等值線

將式（1）分別對各自變量（X1、X2和X3）求偏導數并均令其為0，即可得到一個三元一次線性方程組，通過解此線性方程組得到最大黃曲霉毒素B1降解率和對應的極值點。預測最佳點為：X1＝200，X2＝77.8，X3＝2.51；代入回歸方程，得最佳產物得率Y＝52.03%。因此，模型預報的最佳參數為作用功率200 W、作用時間77.8 s、極距2.51 cm。但考慮到實際操作的便利，將等離子體的最佳條件工藝修正為作用功率200 W、作用時間80 s、極距3 cm。按照此工藝條件降解黃曲霉毒素B1，實際降解率可達51.67%，與預測值基本一致（相對誤差0.69%），表明該方程與實際情況擬合得較好，充分驗證了所建模型的正確性。

3 結論

3.1 等離子體對黃曲霉毒素B1有顯著的降解效果，降解效果與等離子體作用功率、作用時間、極距等因素有關，影響順序為作用功率＞作用時間＞極距。

3.2 本試驗范圍內，等離子體處理黃曲霉毒素B1的最佳工藝條件為作用功率200 W、作用時間80 s、極距3 cm，降解率可達51.67%。

3.3 等離子體處理簡單快速、無化學污染、低能耗易管理，很容易實現與現有的農產品生產線耦合鏈接，其產業化應用前景十分廣闊。

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