響應面分析水酶法提取茶葉籽油工藝優化研究

王曉琴

（華僑大學，廈門 361021）

茶（Camellia sinensisO．Ktze）是山茶屬（Camellia）植物，其同屬近緣種油茶、山茶花均為油料作物。茶葉籽含油率18%～30%，另含有約10%的茶皂素、豐富的淀粉、蛋白質和可溶性糖，同時含有茶多酚、生育酚（VE）等成分［1－3］，我國衛生部 2009年發布第18號公告批準茶葉籽油等7種物品為新資源食品。然而在茶業生產中茶葉籽作為生產廢料并未廣泛開發，大量資源被焚燒或廢棄。我國作為茶葉大國，茶葉籽資源開發經濟效益和應用前景不可估量［4］。

水酶法是一種較為先進的油脂提取技術，具有“安全、高效、綠色”等特點，滿足食用油生產要求，在菜籽、橄欖、葡萄籽、玉米胚芽、油茶等油料作物上均見開展研究［5－9］，尤其在花生、核桃油脂及蛋白綜合提取表現出獨特的技術優勢［10－11］。在油脂提取過程中中性蛋白酶具有減輕乳化程度及避免調節pH影響油脂品質等優勢，本試驗采用中性蛋白酶對茶葉籽油提取工藝進行探索，并探索廢棄液中副產物茶皂素得率，旨在為茶葉籽綜合開發提供基礎資料及理論依據。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

鐵觀音茶葉籽：安溪茶葉科學研究所。

中性蛋白酶：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醚、硫酸：國際集團化學試劑有限公司；香蘭素、香草醛：阿拉丁公司。

DF－Ⅰ集熱式磁力攪拌器：江蘇省榮華儀器制造有限公司；RE52CS旋蒸蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；SHZ－D（Ⅲ）循環水式真空泵：上海賀德實驗設備有限公司；Ⅴ－1200型可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1．2 試驗方法

1．2．1 提取工藝流程

茶葉籽→干燥→去殼→脫衣→粉碎→稱量→滅酶→冷卻→酶解→二次滅酶→離心→分液

1．2．2 單因素試驗

在料液比為1∶4（g∶mL）、酶解溫度為 45℃條件下酶解2．5 h，考察1、4、7、10、13 mL酶溶液（0．4%）對出油率的影響，同時對提取工藝副產物茶皂素得率進行測定；

在酶用量7 mL、酶解溫度為45℃條件下酶解2．5 h，考察料液比（g∶mL）1∶2、1∶3、1∶4、1∶5及 1∶6對出油率的影響，同時對提取工藝副產物茶皂素進行測定；

在酶用量7 mL、料液比為1：4酶解2．5 h條件下，考察酶解溫度 30、37．5、45、52．5、60℃（因儀器條件限制，試驗設計中溫度涉及小數均在操作過程中依據四舍五入原則取整處理）對出油率的影響，同時對提取工藝副產物茶皂素進行測定。

在酶用量7 mL、料液比為1∶4、酶解溫度為45℃條件下，考察酶解時間 0．5、1．5、2．5、3．5、4．5 h對出油率的影響，同時對提取工藝副產物茶皂素進行測定。

1．2．3 中心組合試驗

根據Box－Behnken中心組合試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，確定中心組合試驗因素與水平，見表1。

表1 試驗因素水平及編碼

1．2．4 測定方法

茶皂素測定采用香草醛一硫酸法［12］。

式中：c為通過標準曲線由吸光度計算出此時茶皂素的濃度／mol／L；V為測定時吸取的體積數；N為稀釋倍數；m為被測樣品質量／g。

1．2．5 數據分析

采用軟件Excel 2007和Design Expert 7．0。

2 結果與討論

2．1 酶用量對茶葉籽油及其茶皂素得率的影響

中性蛋白酶可降解脂蛋白，從而將油脂從復合體中釋放出來［8］。圖1表明隨著酶用量的增加，油得率也隨之增加。添加10 mL酶溶液時油得率達到最大值為21．6%，此時油脂提取率達到70．57%，繼續增大酶使用量出油率略微減小；對于茶皂素的浸出，添加1～10 mL酶溶液茶皂素浸出量隨酶量增加而增加，當酶量為底物的10 mL時達到峰值5．7%，但在整個范圍里茶皂素的浸出量變化不大。可見添加10 mL酶溶液是中性蛋白酶提取油脂最適酶用量。

圖1 酶用量對出油率和茶皂素浸出量的影響

2．2 酶解溫度對茶葉籽油及茶皂素得率的影響

溫度是影響酶促反應速率的主要因素，在一定溫度范圍內隨著溫度升高物質活化能增大，酶促反應加快；溫度過高可能導致酶活性下降甚至失活［13］。由圖2可知：在30℃至52．5℃的范圍里，隨著溫度升高油得率增大，反應溫度為52．5℃時茶葉籽油得率達到峰值，此時油得率達到了22．6%，之后隨著反應溫度進一步加大油得率下降；而對于茶皂素在此研究條件下，隨著溫度升高浸出量不斷增大，溫度對其溶解度的正向影響可能是原因之一。由此可得，水酶法提取茶葉籽油最適溫度是52．5℃；對于茶皂素的浸出研究，此試驗沒有峰值，在此試驗研究條件下茶皂素的浸出量隨著溫度的增大而增大。

圖2 酶解溫度對出油率和茶皂素浸出量的影響

2．3 料液比對茶葉籽油及茶皂素得率的影響

料液比通過影響酶與底物接觸機會來調節反應速度［13］，對出油率和茶皂素得率影響見圖3。隨著料液比增大油得率逐漸增大，當料液比達到1∶5油得率最高，此時出油率達到22．0%，之后隨著料液比進一步加大，油得率下降；在1∶2至1∶6范圍內，隨著料液比增大可能促進溶解度增大，茶皂素得率從而一直保持增大趨勢。可見，茶葉籽油提取最適料液比為1∶5；對于茶皂素的浸出研究，若要得到更大的浸出量，則應該考慮進一步加大料液比。

圖3 料液比對油得率和茶皂素得率的影響

2．4 酶解時間對茶葉籽油及茶皂素得率的影響

從圖4可見，酶解時間0．5～3．5 h內，隨著時間延長酶促反應較為充分，油得率逐漸增加；在3．5 h時出油率最高，出油率達到21．5%；3．5 h后繼續延長反應時間油得率逐漸降低，而茶皂素得率隨著時間延長增加。因此，提取茶葉籽油最適反應時間為3．5 h，對于茶皂素提取研究此試驗沒有峰值，所以還需進一步延長時間才能達到較大的茶皂素浸出量。

圖4 時間對出油率和茶皂素浸出量的影響

2．5 響應面分析方案及結果

利用Design Expert軟件對表2中試驗數據進行回歸分析，得二次多元回歸模型方程：Y＝－65．950＋3．011X1＋1．522X2＋10．167X3＋5．685X4＋0．167X1X3－0．108X1X4＋0．043 3X2X4－0．300X3X4－0．166X12－0．0157X22－1．059X32－0．797X42，模擬的可靠性可通過方差分析及相關系數來考察，見表3。

表2 水酶法提取茶葉籽油響應面分析方案及結果

續表

表3為回歸分析結果，當“P＞F”值小于0．05時，即表示該項指標顯著。從結果可以看出：F回歸＝25．46，P＜0．000 1，表明二次多元回歸模型極其顯著；F失擬＝2．71，失擬項P＝0．174 1＞0．05，表明模擬失擬度不顯著；并且該模型的調整確定系數R2＝0．950 2，說明該模型能解釋95．02%響應值的變化，因而該模型擬合程度比較好，試驗誤差小。因此，可以用此模型對茶葉籽油提取工藝進行分析和預測。一次項X1、交叉項X1X3、及二次項對茶籽油提取率的曲面效應極為顯著，X1X4、X2X4顯著，說明它們對響應值影響極大，且所考察因素對響應值影響不是簡單的一次線性關系。

表3 回歸系數取值及分析結果

為了進一步驗證最佳點的取值，對回歸方程取一階偏導等于零數并整理得：

0＝3．011＋0．167X3－0．108X4－0．332X1

0＝1．522＋0．043 3X4－0．031X2

0＝10．167＋0．167X－0．300X－2．118X2143

0＝5．685－0．108X1＋0．043X2－0．300X3－1．593X4

求解方程得到最佳優化提取條件：酶量10．83 mL，溫度52．96℃，料液比1∶5．19，反應時間3．30 h，由回歸方程預測在此條件下茶籽油得率的理論值為25．926%。結合試驗條件采用酶量10．83 mL、溫度53℃、料液比1∶5．19、反應時間 3．30 h開展驗證試驗，茶葉籽油得率分別為 26．075%、26．094%、25．990%，平均值為26．053%，與理論預測值接近且相對誤差僅為0．5%，表明此模型對茶葉籽油提取條件參數優化可行。單因素試驗表明油脂提取廢棄液可用于開發茶皂素，但由于二者最優工藝不一致，中心復合試驗僅考察出油率。

3 討論與結論

本研究采用中性蛋白酶開展茶葉籽油提取研究，建立了油得率與工藝條件參數間的數學模型：Y＝－65．950＋3．011X1＋1．522X2＋10．167X3＋5．685X4＋0．167X1X3－0．108X1X4＋0．043 3X2X4－0．300X3X4－0．166X12－0．0157X22－1．059X32－0．797X42，優化工藝條件結果為酶量10．83 mL、溫度53℃、料液比1∶5．19、反應時間 3．30 h，出油率可達26．083%，為科學開展復合酶后續研究奠定了基礎。另外，本文揭示油脂提取廢液可用于開發副產物茶皂素，為茶葉籽綜合開發提供了新思路。

中性蛋白酶通過降解肽鍵將油脂從蛋白質束縛中解放出來，實現油脂提取效果。茶籽中蛋白質具有乳化作用，在油脂提取過程中阻礙了油水兩相分離，降低了油脂提取率。中性蛋白酶降解蛋白質，具有一定破乳效果，與果膠酶等水解酶相比，油脂提取過程中乳化現象得到緩解，另外具有成本較低、免調pH等優勢，在水酶法提取油脂中具有較大的應用潛力。

志謝：在本試驗工作中，劉慶偉、林克利同學付出了大量的努力，在此一并致謝！

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