同型半胱氨酸對BMVECs 凋亡相關(guān)基因BCL-2/BAX 表達的影響

孫文萍，謝春香，趙節(jié)緒

高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)引起動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的機制還不完全清楚，但是研究發(fā)現(xiàn)，同型半胱氨酸可以破壞血管內(nèi)皮細胞，促進其凋亡，造成內(nèi)皮功能障礙［1，2］，這是其中一項重要的機制。本實驗通過培養(yǎng)大鼠的腦微血管內(nèi)皮細胞(brain microvascular endothelial cells，BMVECs)，研究同型半胱氨酸促使BMVECs 產(chǎn)生凋亡的可能途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

RPMI-1640 培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Gibco，美國);膠原酶Ⅱ型(sigma，美國)、促內(nèi)皮細胞生長因子(Roche，美國)、D，L-homocysteine(Hcy)(Sigama美國)、生物素化山羊抗兔IgG(北京中山試劑公司)、兔抗NF-κB p65 多克隆抗體(Santa Cruz，美國)，總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Sigama，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒、引物購自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 BMVECs 細胞培養(yǎng)及鑒定

本實驗室已經(jīng)培養(yǎng)成功并通過Ⅷ因子抗原免疫染色鑒定的大鼠BMVECs，取第三代細胞用于實驗。

1.2.2 MTT 實驗

按1×103～1×104/ml 密度接種細胞于96 孔培養(yǎng)板中，分成兩大組，待細胞貼壁后一組加不同濃度藥物(Hcy 50μmol/L、Hcy 200μmol/L、Hcy 1000μmol/L、Hcy 2000μmol/L)和CuSO4(4μmol/L)共同培養(yǎng)18h;另一組只加不同濃度的Hcy 進行培養(yǎng)，每種濃度平行8 孔;另設(shè)對照組。干預(yù)18h 后每孔加入MTT 溶液20ml，37℃，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，然后每孔加入150ml DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解;選擇570nm波長，以空白培養(yǎng)液調(diào)零點，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值A(chǔ)，記錄結(jié)果。實驗重復(fù)3 次，繪制時間、劑量效應(yīng)曲線。

1.2.3 細胞免疫化學(xué)法(ABC 法)檢測NF-κB p65 的表達

細胞爬片后固定、封閉，分別加入一抗和二抗后顯色，于Luzex-F 圖像分析儀(加拿大)下計數(shù)每張片子5 個視野的NF-κB p65 陽性細胞率。

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印記分析(Western-bolt 法)NF-κB p65 的表達

取1×107細胞提取胞核蛋白，電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的PBS液浸泡硝酸纖維膜，以封閉非特異抗體結(jié)合。加入一抗兔抗NF-κB p65 多克隆抗體(1∶1000)，常溫下?lián)u振4h，加二抗HRP 羊抗兔IgG(1∶5000)常溫下?lián)u振2h。ECL 檢測試劑盒顯影，X 線壓片曝光，HPIAS-1000 型圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.2.5 RT-PCR 法檢測Bax 及Bcl-2 的表達

BMVECs 分為4 組，分別加入1mmol/L 的Hcy及4μmol/L CuSO4，各培養(yǎng)0、6、12 和18h 后，分別收集細胞，提取總RNA，以2μg 總RNA 進行反轉(zhuǎn)錄。擴增Bcl-2(正義引物:5 ’-CACCC2CTGGCATCTTCT-CCTT-3’，反義引物:5’-CACAATCCTCCCCCAGTTCACC-3’，)，擴增產(chǎn)物長度為304bp;Bax(正義引物:5’-ATGGCTGGGGAGACACCTGAG-3 ’，反義引物:5 ’-CTAGCAAAGTAGAAGAGGGCAAC-3’);，擴增產(chǎn)物長度為240 bp;內(nèi)參照β-actin(正義引物:5’-TTGTAACCAACTGGGACGATATGG-3’，反義引物:5 ’-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3’)，擴增產(chǎn)物長度為764 bp。擴增條件:94 ℃變性1min，55 ℃退火1min，72 ℃延伸2min，循環(huán)35 次。擴增完畢后取PCR 產(chǎn)物10μl 于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測，凝膠圖像分析儀(法國VL 公司，Bio-ID)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MTT 結(jié)果

細胞培養(yǎng)18h 后，我們發(fā)現(xiàn)，單獨添加Cu-SO(4μmol/L)組的細胞存活率沒有受到影響;培養(yǎng)液中不含CuSO4(4μmol/L)時，各Hcy 濃度組細胞OD570 值無顯著區(qū)別(P＞0.05);當(dāng)培養(yǎng)液中添加CuSO4(4μmol/L)時，Hcy 濃度為1mmol/L 及2 mmol/L 的兩組細胞OD570 值明顯降低(P 分別為0.034 和0.006)，而 Hcy 濃度為50μmol/L、200μmol/L 的兩組細胞OD570 值較對照組差異不顯著(P＞0.05))。因此以后的試驗中，我們選用的Hcy 干預(yù)濃度為1 mmol/L(含CuSO44μmol/L)。

2.2 NF-κB p65 表達的免疫細胞化學(xué)檢測

正常情況下，即血管內(nèi)皮細胞未受到外界刺激時，由于NF-κB 和IκB-α 蛋白質(zhì)結(jié)合成三聚體形式存在于細胞質(zhì)，NF-κB 處于未活化狀態(tài)。故1mmol/L 的Hcy+4 μmol/L CuSO4干預(yù)細胞后，0h 組細胞染色后NF-κB p65 只在細胞漿表達，胞漿染色淡;6h后，NF-κB 不僅在細胞漿內(nèi)表達增強，而且轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)表達，發(fā)生核轉(zhuǎn)移，謂之陽性細胞(P＜0.05)，在12h 時達高峰，細胞核著色明顯，陽性細胞百分數(shù)顯著增多(P＜0.01);而到18h 時，NF-κB 核轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象開始減弱(P＞0.05)。

2.3 NF-κB 表達的Western-blot 法檢測

Western 印跡雜交結(jié)果與免疫細胞化學(xué)結(jié)果基本一致。在對照組細胞的核蛋白提取液中，基本沒有NF-κB 的表達;1.0mmol/L Hcy+4 μmol/L Cu-SO4刺激細胞6h 出現(xiàn)核蛋白提取液中NF-κB 的表達，12h 時達高峰，到18h 時表達減少。

2.4 Bax 及Bcl-2 mRNA 的表達

Hcy 作用后0～18h，細胞Bcl-2 mRNA 水平逐步降低，而Bax mRNA 水平逐步升高。二者的比值呈下降趨勢(見圖1～圖4)。

圖1 不同時間點Bcl-2 與β-actin 的mRNA 比值

圖3 不同時間點Bax 與β-actin 的mRNA 比值

圖4 不同時間點Bax 的mRNA 表達

3 討論

細胞凋亡是一個極其復(fù)雜、精密的過程，涉及到許多事件的發(fā)生，包括凋亡相關(guān)基因表達的升高或下調(diào)等。已證實，細胞凋亡的發(fā)生主要通過兩條途徑產(chǎn)生:即線粒體凋亡途徑和死亡受體(Fas-FasL)介導(dǎo)的途徑［3］。在病理條件下，Hcy 攻擊的主要靶細胞是血管內(nèi)皮細胞，它可以造成血管內(nèi)皮細胞凋亡，是發(fā)生動脈硬化的始動部位。有研究認為，Hcy可以通過多方面的作用引起內(nèi)皮細胞凋亡。Austin認為Hcy 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡主要有兩個途徑［4］:其一為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)介導(dǎo)的細胞凋亡;此外，胱冬酶-3(caspase-3)的激活是Hcy 引起細胞凋亡的另一機制。Hcy 能造成細胞內(nèi)ROS 增加，使線粒體失去正常的跨膜電位，導(dǎo)致細胞色素C(cytochrome-c)的釋放，進而激活caspase9、6、3，最后出現(xiàn)核蛋白降解，DNA 斷裂，細胞死亡［5］。Kerkeni 發(fā)現(xiàn)，Hcy 的衍生物同型半胱氨酸硫內(nèi)酯(homocysteine thiolactone)，通過激活caspase-3 使人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)細胞DNA 斷裂，細胞死亡［6］。在這一病理過程中，caspase-3 和線粒體細胞色素C 的活性和釋放均明顯增加［7］。在caspase-3 和線粒體細胞色素C 介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑中，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變孔(permeablity transition pore，PTP)的開放和關(guān)閉是決定細胞是否發(fā)生凋亡的關(guān)鍵［8］。而Bcl-2 家族成員對細胞凋亡的調(diào)控主要是通過調(diào)控線粒體的PTP 的開放和關(guān)閉來實現(xiàn)的。其中Bcl-2 和Bax 是一對正負凋亡調(diào)節(jié)基因，Bcl-2可抑制PTP 的開放從而抑制凋亡因子的釋放和阻止凋亡的發(fā)生，而Bax，Bad，Bak 等作用恰恰相反，它們促進PTP 開放，從而促進凋亡因子釋放。細胞中的Bax 蛋白可自身形成同源二聚體，并易與Bcl-2蛋白形成異源二聚體復(fù)合物，從而使Bax 失活。Bcl-2 表達相對增多時，Bcl-2/Bax 二聚體增多，消除Bax 的促凋亡效應(yīng)，而Bax 表達相對增多時Bax/Bax同源二聚體增加，促凋亡作用上調(diào)。Duan［9］用不同濃度的Hcy 干預(yù)HUVEC 24h，發(fā)現(xiàn)Hcy 可以上調(diào)Bax 的表達，下調(diào)Bcl-2 的表達;Tyagi［5］培養(yǎng)鼠心微血管內(nèi)皮細胞，通過cDNA 芯片檢測發(fā)現(xiàn)，Hcy 使mRNA 水平的Bcl-2/Bax 比值下降，激活caspase9、3，進而引起細胞凋亡。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，Hcy 對BMVECs 的生長有明顯的抑制作用，可以造成細胞死亡。并且干預(yù)組BMVECs 的Bcl-2 mRNA 于處理后0～18h 呈持續(xù)降低趨勢，而Bax mRNA 基本呈增高趨勢，Bcl-2/Bax比值降低。此結(jié)果提示，Hcy 可能通過抑制Bcl-2 基因表達，促進Bax 基因表達，使Bcl-2/Bax 比值降低，致使細胞凋亡和存活信息平衡失調(diào)，從而最終誘導(dǎo)細胞調(diào)亡。可見Bcl-2 和Bax 基因在Hcy 誘導(dǎo)BMVECs 細胞凋亡過程中同樣起著重要的作用。

Bcl-2 和Bax 基因的表達受核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及JNK 等途徑的調(diào)控。有人［4，10，11］在觀察Hcy 對平滑肌細胞及內(nèi)皮細胞的影響時發(fā)現(xiàn)，Hcy 可以激活NF-κB，促進NF-κB 的核轉(zhuǎn)位。用超氧負離子清除劑或I-κB 抑制劑可抑制Hcy 誘導(dǎo)的IKK 激活和NF-κB 激活［12］。我們在蛋白質(zhì)水平上檢測到，Hcy干預(yù)后不同時間點腦微血管內(nèi)皮細胞的NF-κB 的的表達，結(jié)果證實有NF-κB 核轉(zhuǎn)位的變化:6h，NFκB 已經(jīng)出現(xiàn)胞核內(nèi)表達;12h 時達高峰，細胞核著色明顯;18h 時，這一現(xiàn)象開始減弱。已知NF-κB 是能調(diào)節(jié)多種炎癥和免疫基因表達的一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它在相當(dāng)廣泛的病理生理過程中起調(diào)控作用，其中包括細胞凋亡現(xiàn)象。現(xiàn)有的部分實驗研究表明，NF-κB 激活能保護細胞免于凋亡，而另一些研究中則發(fā)現(xiàn)，NF-κB 能促進凋亡基因的表達。可見NF-κB 的激活在細胞凋亡中的調(diào)控作用是多層次多方面的，這可能與研究細胞的種類及所處應(yīng)激環(huán)境不同有關(guān)。本研究中觀察到，隨著NF-κB 的激活，Bcl-2 mRNA 于處理后0-18 h 呈持續(xù)降低趨勢，而Bax mRNA 轉(zhuǎn)錄水平呈增高趨勢，提示在Hcy 致內(nèi)皮細胞損傷的過程中，NF-κB 有可能參與了Bc1-2 和Bax 基因介導(dǎo)的細胞凋亡途徑。

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