采用誘導分化的SH-SY5Y 細胞建立酒精性癡呆體外研究模型的探討

楊海玉，劉 勇

慢性酒精中毒對于人類健康的危害日趨嚴重。大腦是酒精誘導損傷的最常見靶器官之一，長期大量飲酒可引起腦器質性損害，并逐漸發展至癡呆狀態，臨床稱之為酒精性癡呆(alcohol-associated dementia，AAD)［1］。由于其治療手段有限且治療效果不佳，大多數AAD 患者不能完全恢復至正常。酒精屬親脂性小分子化學物質，可迅速通過血腦屏障和細胞膜，對腦組織造成直接損害。目前研究發現，短暫酒精暴露即可產生嚴重的細胞毒性，引起神經元大量死亡;而長期酒精接觸可顯著抑制神經元、星形膠質細胞增殖及降低細胞存活率，導致神經元分化延緩以及結構破壞［2，3］。但是，關于這方面的分子機制還有待進一步深入研究。由于取材受到來源以及倫理學的限制，使用人原代培養神經細胞作為研究對象困難很大。SH-SY5Y 細胞又稱為人神經母細胞瘤細胞，該細胞誘導分化后可表現神經元形態特征，目前常用于神經元損傷模型的研究［4，5］，具有取材培養方便、易行等優勢。因此，在本研究中我們采用維甲酸(retinoic acid，RA)誘導SH-SY5Y 細胞分化，并通過給予不同濃度的酒精連續培養，觀察酒精對SH-SY5Y 細胞的損傷作用，為進一步研究AAD 的發病機制提供簡單可行的體外研究模型。

1 材料與方法

1.1 實驗主要試劑

DMEM 高糖培養基、胰蛋白酶均購自美國Gibco 公司;胎牛血清購自美國Hyclone 公司;RA、四甲基偶氮唑藍［3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］、碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自美國Sigma 公司。

1.2 SH-SY5Y 細胞培養與誘導分化［6］

SH-SY5Y 細胞購自中國科學院細胞庫。細胞培養采用DMEM 高糖培養基加入體積分數為10%的胎牛血清，5%CO2、37℃條件培養細胞，待細胞長至80%～90%融合時，用體積分數為0.25%的胰蛋白酶消化傳代。將細胞按1×104濃度平均接種到96 孔板，待細胞長至60%～70%融合時，換用含體積分數1%胎牛血清的培養基進行培養，并加入終濃度為10μm 的RA 誘導細胞分化，每天換液一次，連續6d，光學顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.3 檢測酒精對SH-SY5Y 細胞增殖的影響

本研究采用MTT 比色法檢測酒精對SH-SY5Y細胞增殖的影響。該細胞誘導分化后，于7d 棄去含RA 的培養基，酒精組細胞分別加入含不同濃度酒精(10～400mol/L)的培養基，對照組細胞加入不含酒精的培養基，置培養箱中連續培養24h。之后，每孔加入20μl MTT 溶液(5mg/ml)，37 ℃培養4h。棄去所有溶液后加入200μl DMSO 溶液，振蕩10min，采用酶標儀570nm 波長檢測光密度(optical density，OD)值，并根據各組OD 值計算細胞存活率。

1.4 檢測酒精對SH-SY5Y 細胞凋亡的影響

PI 是一種能穿過破損細胞膜且與DNA 結合的熒光染料，散發紅色熒光，常用于細胞凋亡檢測。酒精組細胞給予酒精(100mol/L)作用24h 后，棄去培養基，用PBS 洗3 次，然后每孔滴加適量PI 染色液覆蓋細胞，避光染色10min，PBS 洗3 次后采用熒光顯微鏡(型號DM3000，德國徠卡公司)觀察取圖。對照組給予PBS 代替酒精，其余處理同酒精組。凋亡細胞的特征表現為細胞核呈明顯固縮、濃染。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 SH-SY5Y 細胞誘導分化后的形態觀察

如圖1 所示，未分化的SH-SY5Y 細胞呈長梭形，貼壁生長良好(見圖1A);而在使用RA 誘導分化后細胞胞體增大，有較多細長的突起，表現神經元形態特征(見圖1B)。

2.2 酒精對SH-SY5Y 細胞增殖的影響

分化后的SH-SY5Y 細胞經不同濃度酒精作用24 h，采用MTT 法檢測細胞增殖變化。實驗結果顯示，酒精濃度達到100 mol/L 時，與對照組相比，細胞增殖受到明顯抑制(P＜0.05);并且隨著酒精濃度的增加(100～400mol/L)，細胞增殖抑制呈濃度依賴關系(見圖2)。

圖1 SH-SY5Y 細胞形態觀察結果

圖2 MTT 法檢測不同濃度酒精對SH-SY5Y 細胞增殖的作用

2.3 酒精對SH-SY5Y 細胞凋亡的影響

如圖3 所示，酒精組(100mol/L)細胞凋亡現象明顯，可見大量細胞表現胞核皺縮、濃染(PI 染色陽性)(見圖3B)，而對照組則少見凋亡細胞存在(見圖3A)。

圖3 PI 染色檢測酒精誘導SH-SY5Y 細胞凋亡結果

3 討論

AAD 是慢性酒精中毒最為嚴重的精神病狀態，也是長期大量飲酒引起腦器質性損害的結果，臨床表現記憶力缺損伴其他認知功能障礙為其主要特征。研究結果顯示慢性酒精中毒已成為誘導癡呆發病的重要因素，AAD 患者可占癡呆發病人群的21%～24%［7］。目前研究表明慢性酒精中毒導致的腦損害是一個慢性進展性過程，呈不可逆性并伴有多種病理學改變。研究證實慢性酒精中毒患者的特定腦區可出現選擇性神經元或神經核團丟失、神經軸突減少以及復雜性突觸結構退化等病理變化，其機制與慢性酒精作用促進氧化應激和神經炎性反應、抑制神經營養因子和粘附分子表達、破壞神經膠質細胞及其功能、影響神經遞質釋放以及干擾細胞內信號傳導等密切相關［8～10］。目前有關酒精與癡呆發生的關系及其具體分子機制仍不十分清楚，因此建立簡便易行的酒精性癡呆體外研究模型將有助于深入探討這類疾病的發病機制。

SH-SY5Y 細胞具有神經元分化潛能，是目前公認用于神經系統疾病研究的細胞模型。本課題以SH-SY5Y 細胞為實驗對象，以RA 為誘導劑，通過誘導細胞分化，進一步觀察酒精對該細胞的損傷作用。MTT 檢測證實酒精對SH-SY5Y 細胞增殖具有明顯的抑制作用，并且呈濃度依賴性。另外通過PI 染色法進一步觀察證實，酒精可誘導SH-SY5Y 細胞發生顯著凋亡。以上結果提示SH-SY5Y 細胞對酒精誘導損傷敏感，可用于建立研究AAD 發病機制的體外模型。

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