膠州灣海域PAHs污染與可培養半知菌的多樣性

姜會超, 田 黎, 史振平 張久明

(1.青島科技大學, 山東青島 266042; 2.國家海洋局 第一海洋研究所, 山東青島 266061)

膠州灣海域PAHs污染與可培養半知菌的多樣性

姜會超1,2, 田 黎1,2, 史振平1, 張久明1

(1.青島科技大學, 山東青島 266042; 2.國家海洋局 第一海洋研究所, 山東青島 266061)

用5種不同的培養基對膠州灣近岸污染環境可培養半知菌進行選擇性分離, 共得到235株半知菌, 其中YM培養基、MPDA培養基對半知菌的分離效果最好, 分別占分離總量的26.4%和24.7%。試驗選擇的3個站位: 石老人潮間帶、海泊河入海口、李村河入海口PAHs含量存在顯著性差異(P＜0.05),其中石老人最低, 平均為 113.8 ng/g, 海泊河 PAHs為 324.9 ng/g, 介于中等水平, 李村河含量最高為882.1 ng/g。可培養半知菌群體隨PAHs含量的增加表現出先升高后降低的趨勢。對各站位的半知菌進行統計發現, 污染不同的站位, 可培養半知菌優勢種群不同, 說明PAHs的污染可對半知菌的菌落結構組成產生影響。

膠州灣; PAHs; 半知菌

多環芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是一類廣泛存在于環境中具有“三致作用”(致癌、致畸、致突變)的有機污染物, 環數越高的PAHs對環境的危害相對越大[1]。PAHs以水體中的懸浮物為主要載體, 進入海洋環境后由于難溶于水而不斷累積于沉積物中, 海洋沉積物中的 PAHs的積累量占沉積物中難降解污染物總量的 97%以上, PAHs可通過食物鏈的富集作用對高等生物以及人類健康產生嚴重威脅[2-3]。目前化學分析的方法可以較準確地測試海洋中的PAHs含量, 但不同PAHs含量對海洋生物種群的影響很少見有報道。半知菌是海洋環境分布較廣的一類真核微生物, 環境污染對其優勢種群結構會產生較直觀的影響, 而優勢種群的變化能夠在一定程度上指示環境的污染狀況[4-5]。目前尚未見有海洋環境 PAHs污染與半知菌關系的研究報道,本文選擇污染比較典型的膠州灣作為試驗海域, 通過對可培養半知菌的選擇性分離, 獲得該海域半知菌分離較適合的分離方法, 對污染程度不同的采樣站位的半知菌種群進行統計, 探討半知菌種群結構對PAHs污染的反映。

1 材料與方法

1.1 站位的確定與樣品采集

根據課題組以往調查, 膠州灣海域的李村河(LC)入海口(36°09′N, 120°21′E)、海泊河(HB)入海口(36°06′N, 120°19′E)、石老人(SL)潮間帶(36°04′N, 120°27′E) 分別定為重度、中度污染區和輕度污染區的采樣站位, 采樣以各入海口為中心、根據采樣地形間隔 30 m 為一采樣點, 取不同沉積物表層(0～20 cm), 共取得12個樣品(石老人4個, 海泊河4個,李村河4個), 每個樣品由該采樣點隨機取的3個樣混合組成。樣品分為兩份, 一份裝入預清洗的棕色玻璃瓶中用于 PAHs測定, 一份用于半知菌的分離培養。

1.2 PAHs測定

PAHs測定參照薛荔棟等[6]的方法, 并作適當修改:

樣品經冷凍干燥后研磨通過80目篩網并混勻。稱取篩分混勻樣品 10 g, 與 10 g無水硫酸鈉混合,利用正己烷和丙酮混合試劑(體積比為 1∶1)索氏提取16～24 h。 提取過程中加入高純銅粉脫硫,旋蒸氮吹濃縮至2～3 mL,加入50 mL正己烷替換溶劑, 然后濃縮至近干再加入2 mL正己烷。 濃縮提取液通過硅膠/氧化鋁(體積比為 1∶2)層析柱(柱頂部填充適量無水硫酸鈉和高純銅粉), 再加入40 mL 正己烷淋洗棄去飽和烷烴。此后, 加入80 mL混合溶劑(二氯甲烷+正己烷, 體積比 3∶7)洗脫得到 PAHs組分,經旋蒸氮吹濃縮至1mL。

PAHs組分采用配有 6890N型氣相色譜儀和5975B型質譜檢測器的 Agilent GC-MS進行分析。GC/MS條件: 進樣口溫度是250℃, 柱初始溫45℃,保持1 min, 以6℃/min程序升溫至200℃, 然后以8℃/min程序升溫到300℃, 并保持5 min。載氣為氦氣, 流量1.0 mL/min。不分流進樣, 進樣量為1μL。毛 細 管 柱 : HP-5MS(Agilent 19091S-433)30.0 m×250.0μm×0.25μm。質譜條件: 電子轟擊離子源模式, 離子源溫度為 200℃, 接口溫度 280℃, 電子轟擊能量70 eV, 選擇離子掃描(SIM)方式[7-8]。

1.3 半知菌培養基

海水馬鈴薯(MPDA)培養基, 燕麥片 ( YM)培養基[9-10], 查氏(CA)培養基、WA培養基、孟加拉紅(MJ)培養基、用于真菌分離[11-12]。

為了抑制細菌的干擾, 每種培養基均加入終濃度為50 mg/L的鏈霉素。

1.4 半知菌分離方法

稱取沉積物樣品5 g, 在無菌操作下加入盛有50 mL體積分數為50%無菌人工海水的三角瓶中, 用渦旋振蕩器充分振蕩均勻后, 于200 r/min搖床振蕩10 min后靜置取上清液5 mL, 加入裝有45 mL同樣鹽分無菌人工海水的三角瓶中, 倍半法稀釋使樣品終濃度為10-4、10-5。分別取100 μL涂布在5種不同的培養基上, 每個處理3個重復。

將上述分離平板置于25℃恒溫培養, 5～15 d, 從培養平板內挑取菌落形態和色素不同單細胞的菌落,做好統計以便進行不同培養基分離效果的比較。對所分離到的半知菌再根據菌株生物學與分子生物學分類標準, 確定半知菌的種屬。

1.5 數據處理

實驗數據用 SPSS13.0 統計軟件進行方差分析,并用duncan法進行多重比較。

2 結果

2.1 PAHs測定結果

表1 沉積物樣品PAHs含量測定結果(ng/g)Tab. 1 Concentration of PAHs in surface sediment in different sampling sites(ng/g)

石老人、海泊河、李村河各站位沉積物中16種優先監控的多環芳烴含量測定結果如表1所示。

對各采樣點PAHs總量進行統計, 結果如圖1所示, 通過表 1及圖 1我們可以看出, 石老人站位PAHs污染種類少且含量低, 四個采樣點PAHs總量平均值為113.8 ng/g, 海泊河站位PAHs污染物種類比石老人站位多, 除萘未檢出外, 其他 14種 PAHs污染物均可檢測到, 4采樣點總量平均值為 324.9 ng/g, 是石老人站位的 2.9倍; 李村河入海口站位PAHs污染物種類和每種污染物的含量在3個試驗區最高, 同時該4采樣點PAHs總量波動較大, 最低為327.8 ng/g, 最高為1367.8 ng/g, PAHs總量平均值為 882.1 ng/g, 分別是石老人站位的 7.8倍, 海泊河站位的2.7倍。從各站位PAHs的組成看, 石老人站位PAHs污染主要以3環為主, 含量占50%左右。李村河與海泊河站位 4～5環多環芳烴所占比例較大,含量占60%以上, 對環境的危害較大。

圖1 各采樣點PAHs總量Fig. 1 Contents of PAHs in different sampling sites

2.2 不同培養基分離效果比較

采用CA、MPDA、YM、WA、MJ5種培養基對石老人、海泊河、李村河三個站位共12個樣品進行分離, 對每種培養基在每個采樣點分離到的半知菌菌株數目進行統計, 結果如表2所示。

5種培養基在12個采樣點共分離到235株半知菌, 其中YM培養基、MPDA培養基分離到半知菌的數量最多, 分別分離到62株、58株, 總共占到分離總量51%。其次是CA和WA培養基, 分別分離到47株、40株, MJ培養基分離到的半知菌數量最少,只分離到28株。

表2 不同培養基選擇分離半知菌結果Tab. 2 Statistics of Deuteromycetes species from different isolation medium

對5種培養基的分離結果進行方差分析, 5種培養基的分離效果存在顯著性差異(P＜0.05), 具有統計學意義。為進一步探討各培養基的分離效果, 對其進行多重比較, 結果如表3所示。

由表3可知, YM培養基分離效果最好, 分離到的半知菌種類數比MJ培養基提高了124%, 其次是MPDA、CA、WA培養基, 分離效果分別比MJ培養基提高了108%、70%、43%。MJ培養基分離效果最差。

表3 不同培養基半知菌分離結果多重比較Tab. 3 Multiple comparison of Deuteromycetes species amount from different isolation medium

2.3 不同站位半知菌分布結果

2.3.1 不同站位半知菌菌落總數分布結果

對石老人、海泊河以及李村河三個站位, 12個采樣點的半知菌菌落總數進行統計, 結果如表4所示。

由表4可以看出, 從站位上分析, 半知菌菌落總數在石老人、海泊河、李村河三個站位上表現出明顯的差異(P＜0.05)。半知菌菌落總數在石老人輕度污染區比較低, 為 7.7×105cfu/g。在海泊河中度污染區半知菌菌落總數含量最高, 達到2.2×106cfu/g。到李村河重度污染區半知菌菌落總數降低到 1.3× 106cfu/g。半知菌菌落總數隨著 PAHs污染程度的增加表現出先上升后下降的趨勢。

表4 半知菌菌落總數結果 (105cfu/g)Tab. 4 Total amount of Deuteromycetes in different sampling site(105cfu/g)

2.3.2 不同站位半知菌種類分布結果

經過對分離的235株半知菌分類鑒定, 得到25種不同種屬的半知菌, 其中青霉 11種(Penicilliumsp.),曲霉8種(Aspergillussp.), 枝霉(Cladosporiumsp.)、鐮孢霉(Fusariumsp.)、交鏈孢霉屬(Alternariasp.)、紅絲菌疣孢霉(Mycogone rosea)、單孢霉屬(Monosporiumsp.)、木霉(Richodermasp.)各一種。對半知菌在每個站位的分布情況進行統計, 結果如圖2所示。

圖2 半知菌三站位分布Fig. 2 Distributions of Deuteromycetes in different sampling sites.

由圖2可知, 團青霉(Penicillium commune)、黃青霉(Penicillium chrysogenum)、灰黃青霉(Penicillium griseofulvum)這3種半知菌在石老人、海泊河、李村河3個站位分布比較普遍, 屬于優勢種。污染輕的石老人海域還分布有特異青霉(Penicillium notatum)、小刺 青 霉 (Penicillium spinulosum)、 瓶 梗 青 霉(Paecilomyces Bainier)、殼青霉(Penicillium crustosum)、木霉(Richodermasp.)等, 顯示良好的半知菌多樣性; 擴展青霉(Penicillium expansum)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、交鏈孢霉屬(Alternariasp.)棒曲霉(Aspergillus clavatus)、紅絲菌疣孢霉屬(Mycogone rosea)、單孢霉屬(Monosporiumsp.)薩氏曲霉(Aspergillus sydowi)在污染較重的海泊河、李村河分布較多, 其中棒曲霉(Aspergillus clavatus)、紅絲菌疣孢霉屬(Mycogone rosea)以及單孢霉屬(Monosporiumsp.)只出現在海泊河輕度污染區, 薩氏曲霉(Aspergillus sydowi)只出現在李村河重度污染區。

3 討論

膠州灣的海泊河入海口、李村河入海口流經青島市主要的重工業區, 沿岸居民區密布, 匯集大量城市廢水廢物, 對周圍環境和生物群體結構造成較大影響。課題組以往有關該區域的重金屬、氮磷的調查顯示, 石老人、海泊河、李村河三站位污染級別由輕到重[4],本文的PAHs含量也表現相同趨勢。目前對于海洋 PAHs污染等級的劃分還沒有一個統一的標準, 國內外研究大多采用1995年Long等[13-14]提出的L-ER-M效應評估法。按照此評估法, 采樣的3個站位PAHs含量尚未超過最低危害值。但已引起半知菌菌落結構的較明顯變化, 除了其他污染物的綜合效應外, PAHs對生物的危害不容忽視。

目前對微生物多樣性的評估不少研究都使用分子生物學手段, 但可培養種類涉及該生境微生物的進一步利用, 如污染指示、污染降解等, 在環境調查與研究中也是必不可少, 污染海洋環境半知菌的分離與調查, 國內外均未見有相關報道,

本研究進行了有益的探索, 獲得的結果證明: YM 培養基對半知菌的分離效果最好, 分離到的半知菌種類最為豐富, 不但將樣品中廣泛存在的團青霉(Penicillium commune)、黃青霉(Penicillium chrysogenum)、灰黃青霉(Penicillium griseofulvum)等優勢種分離出來, 還獲得小刺青霉(Penicillium spinulosum)、瓶梗青霉(Paecilomyces Bainier)等海洋環境少見的種, 利用優勢種研究對環境指示作用的研究正在進行中。

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(本文編輯: 張培新)

Culturable deuteromycetes diversity and PAHs contamination in Jiaozhou bay

JIANG Hui-chao1,2, TIAN Li1,2, SHI Zhen-ping1, ZHANG Jiu-ming1
(1. Qingdao University of Science & Technology, Qingdao 266042, China; 2.The First Institute of Oceanography, SOA, Qingdao 266061, China)

May,11,2012

Jiaozhou bay; PAHs; deuteromycetes

Five different kinds of culture medium were used to selectively isolate culturable Deuteromycetes in contaminated coast of Jiaozhou bay and 235 strains of Deuteromycetes were obtained. Among the medium, YM and MPDA isolated Deuteromycetes the best. The isolate rates of the total isolated-strains of YM and MPDA were 26.4% and 24.7%, respectively. PAHs contents among the three sampling sites manifested significant difference (P＜0.05) with the lowest in Shilaoren tidal zone (average 113.8ng/g), moderate in Haibo River estuary (average 324.9 ng/g) and the highest in Licun River estuary (average 882.1ng/g). On the basis of the changes of PAHs contents in different sites, with the increase of PAHs amount, the amount of culturable Deuteromycetes increased in certain degree and then decreased. Further research showed that the dominant species differed in the three sites with different PAHs contents which indicated PAHs contamination might exert effect on the composition of Deuteromycetes colony.

X55

A

1000-3096(2013)05-0033-06

2012-05-11 ;

2012-06-02

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAE06B04); 國家863計劃項目(2011AA10A202-2, 2011AA09070402); 海洋公益項目(201005032-2)

姜會超(1984-), 男, 山東青島人, 碩士, 主要從事海洋微生物的研究, E-mail: jianghuichao2008@163.com; 田黎, 通信作者,電話:86-532-88967423, E-mail: wshw8@yahoo.com.cn