菲降解菌巨大芽孢桿菌在土壤中的運(yùn)移規(guī)律

耿 婧，于少云，寇 堯，周 延

（北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院制藥工程系，北京100029）

多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境和食品污染物，相當(dāng)一部分具有致癌性，自然降解速度極慢，已成為當(dāng)今環(huán)境策略的重要議題。現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)微生物具有快速降解多種多環(huán)芳烴的能力，因此原位微生物修復(fù)技術(shù)是治理土壤污染的優(yōu)選措施之一［1］。為了更好地指導(dǎo)微生物的環(huán)境修復(fù)，人們對微生物在土壤中的遷移模型做了大量研究，這些模型都是針對某種特定微生物，在對流－彌散方程基礎(chǔ)上綜合考慮微生物的生長－衰亡、吸附－解吸的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，土壤顆粒表面對微生物的吸附解吸作用是影響其遷移最主要的因素，幾乎影響微生物遷移的所有因素 （如靜電作用力、范德華力、疏水作用力等）都是通過影響吸附解吸來起作用的。若將微生物視做具有一定吸附－解吸特性的某種物質(zhì)進(jìn)行研究，所有影響微生物表面特性的理化因素都將影響該過程，這些因素主要包括微生物的體積、鞭毛運(yùn)動、形狀系數(shù)、表面電位、細(xì)胞膜組成等。本研究希望通過對不同微生物的表面特性因素與吸附－解吸表觀常數(shù)的測定與分析，探索尋找微生物運(yùn)移中影響其吸附－解吸特性的一些共性規(guī)律。

研究首先對本實(shí)驗(yàn)室選育的具有多環(huán)芳烴降解能力的巨大芽孢桿菌在土壤中的運(yùn)移模型各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)測定，然后選擇了對6種在體積、鞭毛運(yùn)動、形狀系數(shù)、表面電位、細(xì)胞膜組成等方面具有一定差異的微生物，測定其在土壤中的吸附解吸過程，探尋這些影響表面特性的參數(shù)對其在土壤中吸附常數(shù)與解吸常數(shù)的影響。

1 材料和方法

（1）供試菌種：巨大芽孢桿菌 （本實(shí)驗(yàn)室自有菌）、假單胞菌 （本實(shí)驗(yàn)室自有菌）、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、微球菌。

（2）供試土壤：供試土壤采自于北京化工大學(xué)，采回的土樣除去土壤中的碎石、枯枝敗葉，風(fēng)干后過2 mm篩、待用。

（3）TY培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，酵母膏5.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)液2.0 mL，加去離子水至1 L，調(diào)p H值至7.5，115℃高壓滅菌30 min。

（4）無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)液：NaNO34 g，KH2PO41.5 g，Na2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.01 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0011 g，加去離子水至1 L，121℃高壓滅菌30 min。

（5）菌懸液的制作：巨大芽胞桿菌接種于液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)16～24 h后，6000 r／min，10 min離心收集菌體，磷酸緩沖液洗滌，重懸于磷酸緩沖液中，做成菌懸液。

（6）砂土的處理：將過2 mm篩的砂土浸在稀鹽酸溶液中，24 h后，用自來水沖洗至p H值中性，再用去離子水沖洗兩遍，烘干。然后裝在錐形瓶中滅菌3 h。

（7）平衡吸附試驗(yàn)：采用批量平衡法測定了菌在砂土表面的吸附。本實(shí)驗(yàn)5個(gè)菌懸液的梯度濃度分別為0.1×108CFU／m L、0.5×108CFU／m L、1.0×108CFU／m L、1.5×108CFU／m L、2.5×108CFU／m L，每組設(shè)2個(gè)平行樣。按1∶2的土水比加入滅菌土樣并將錐形瓶密封，置于恒溫?fù)u床中進(jìn)行振蕩（恒溫30℃，轉(zhuǎn)速120 r／min）。

（8）動力學(xué)實(shí)驗(yàn)：按照張瑞玲等［4］提到的微生物在土壤中吸附動力學(xué)的研究方法，用間歇法確定吸附平衡時(shí)間。將在富集培養(yǎng)基上生長24 h后的菌體以6000 r／min離心10 min收集菌體，用磷酸緩沖液洗滌兩次，重懸于磷酸緩沖液中，裝入250 mL錐形瓶中，制得一定初始濃度的菌液。之后，按1∶2的土水比加入滅菌土樣，置于恒溫?fù)u床中進(jìn)行振蕩 （恒溫30℃，轉(zhuǎn)速150 r／min）。每10 min從中取出一次樣品，靜置0.5 h，取上清液測定菌體個(gè)數(shù)。每個(gè)濃度重復(fù)3次。

（9）彌散系數(shù)測定實(shí)驗(yàn)：采用土柱實(shí)驗(yàn)，0.01 mol／L NaCl溶液，測定出口處Cl－的濃度，Cl－的測定用Ag N03滴定法。

（10）生長項(xiàng)系數(shù)測定實(shí)驗(yàn)：微生物在土壤中的遷移往往忽略微生物的生長，采用Monod方程［4］計(jì)算微生物在土壤中遷移過程的生長項(xiàng)系數(shù)，用微生物降解菲的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。降解條件為：搖床轉(zhuǎn)速150 r／min，溫度28℃，p H值為7.0，初始巨大芽胞桿菌濃度1 mg／L，底物濃度（即葡萄糖濃度）1 g／L。

2 數(shù)學(xué)模型

本實(shí)驗(yàn)選用一級動力學(xué)吸附模型［5］來描述細(xì)菌在土柱中的運(yùn)移模型，有以下4個(gè)假設(shè)前提：①土壤是勻質(zhì)體；②水流恒定；③土壤孔隙率恒定；④微生物細(xì)胞在液相中均勻懸浮。在上述前提條件下，菌的運(yùn)移方程如式 （1）。

式中，θ為介質(zhì)體積含水率，對于飽和土壤，則是介質(zhì)有效孔隙度；C為微生物在水相中的濃度，mg／m3；S為微生物在固體表面可逆吸附的菌濃度，mg／g；ρ為土壤的容重，g／m3；D為水動力彌散系數(shù)，m2／s；v為流速，m／s；katt為可逆吸附常數(shù)，s－1；kdet為可逆解吸常數(shù)，s－1；σ為微生物的比增長速率，T－1。

等式左邊表示微生物的積累，右邊第一項(xiàng)為水動力彌散項(xiàng)，第二項(xiàng)為對流項(xiàng)，第三項(xiàng)為吸附項(xiàng)，第四項(xiàng)為解吸項(xiàng)，第五項(xiàng)為微生物生長衰亡項(xiàng)。

3 結(jié)果與討論

3.1 巨大芽孢桿菌在土壤中的運(yùn)移模型

3.1.1 平衡吸附參數(shù)

圖1 巨大芽孢桿菌在土壤中的等溫吸附線

土壤顆粒表面對微生物的吸附是物理化學(xué)作用，主要范德華力、靜電作用力、疏水作用力等。常見的等溫吸附模型有以下4種：線性平衡吸附、Freundlich平衡吸附、Langmiur平衡吸附、Temkin平衡吸附。根據(jù)測定菌液平衡濃度和質(zhì)量進(jìn)行計(jì)算，可得到最適吸附模型。圖1為巨大芽孢桿菌4種吸附模型的回歸曲線，可以看出該巨大芽孢桿菌最符合Freundlich平衡吸附模型，相關(guān)性為99.4%。實(shí)驗(yàn)測得該巨大芽孢桿菌在砂土中的平衡吸附參數(shù)為2.307 mL／g。

3.1.2 動態(tài)吸附參數(shù)

按照第1節(jié)所提到的方法，首先確定巨大芽孢桿菌在土壤中達(dá)到吸附平衡的時(shí)間，如圖2所示，約在1 h內(nèi)吸附達(dá)到平衡，然后選擇吸附平衡前的時(shí)間范圍內(nèi)考察其動態(tài)吸附。在已知土壤有效孔隙度和土壤容重的條件下，采用Sim［6］提出的一般情況下等溫過程可逆吸附形式，見式 （2）。

圖2 巨大芽孢桿菌吸附隨時(shí)間的變化

圖3 巨大芽孢桿菌在土壤中的動態(tài)吸附

3.1.3 彌散系數(shù)與生長項(xiàng)系數(shù)

土柱實(shí)驗(yàn)中水流速度恒定，用Cl－濃度的BTC擬合得到彌散系數(shù)D為3.2×10－6cm2／s。采用最小二乘法擬合得到巨大芽孢桿菌的生長項(xiàng)系數(shù)為3.97×10－9。約為其它項(xiàng)系數(shù)的10－4倍，所以本實(shí)驗(yàn)中巨大芽孢桿菌的生長項(xiàng)系數(shù)可以忽略不計(jì)，也就是說巨大芽孢桿菌的生長衰亡率對其在土壤中運(yùn)移的影響可以忽略。

3.1.4 巨大芽孢桿菌的模型

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到該巨大芽孢桿菌在土壤中運(yùn)移模型的各項(xiàng)參數(shù)，在30℃，1 g／L葡萄糖濃度條件下忽略該巨大芽孢桿菌的生長項(xiàng)系數(shù)，得到的方程如式 （3）。

3.2 表面參數(shù)對菌在土壤中吸附－解吸的影響

批量平衡法測定吸附的結(jié)果表明，巨大芽孢桿菌、假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及微球菌在砂土上的吸附符合Freundlieh方程，即S＝KCn。金黃色葡萄球菌在沙土上的吸附符合線性平衡吸附方程，即S＝KC。

根據(jù)第1節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法和第3.1節(jié)的求解方法求其余5種菌體的吸附常數(shù)katt、解吸常數(shù)kdet。6種菌體的物理性質(zhì)和吸附解吸常數(shù)結(jié)果見表1。

與水對流相比較，微生物自身趨化運(yùn)動很小，往往可以忽略。僅在靜態(tài)的條件下，趨化作用才變得比較明顯。本實(shí)驗(yàn)采用動態(tài)實(shí)驗(yàn)，故可考慮忽略微生物的趨化運(yùn)動，即忽略微生物鞭毛運(yùn)動對其在土壤中運(yùn)移的影響。

對以上6種菌的粒徑 （A）、形狀系數(shù) （B）、電位 （C）對吸附常數(shù) （z1）、解吸常數(shù) （z2）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)回歸分析，假設(shè)它們之間的關(guān)系符合式 （4）、式（5）。

式中，D1，D2為未知常數(shù)；x1，x2，x3，y1， y2，y3為所探求的未知數(shù)。

對等式兩邊取以10為底的對數(shù)，則可轉(zhuǎn)化為式（6）、式（7）。

根據(jù)概率論與數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)，運(yùn)用多元線性回歸方法、最小二乘法、回歸系數(shù)檢驗(yàn)方法求解，得到它們之間的關(guān)系為式 （8）、式 （9）。

從回歸結(jié)果初步看到，吸附常數(shù)、解吸常數(shù)與微生物自身表面特性參數(shù)的一些關(guān)系規(guī)律。

（1）吸附常數(shù)與微生物的體積負(fù)相關(guān)；與微生物的形狀系數(shù)、電位絕對值正相關(guān)。即當(dāng)微生物體積較小、形狀系數(shù)較大、電位絕對值較高時(shí)，土壤顆粒對其吸附能力強(qiáng)，從回歸的冪次看，對吸附常數(shù)影響作用由大到小依次為電位、形狀系數(shù)、粒徑。

（2）解吸常數(shù)與微生物的體積負(fù)相關(guān)；與微生物的形狀系數(shù)、電位絕對值正相關(guān)；即當(dāng)微生物體積較小、形狀系數(shù)較大、電位絕對值較高時(shí)，土壤顆粒對其解吸能力強(qiáng)，從回歸的冪次看，對吸附常數(shù)影響作用由大到小依次為形狀系數(shù)、電位、粒徑。

（3）對比吸附和解吸回歸結(jié)果可以看到，在吸附過程中電位是首要因素，而在解吸過程中形狀系數(shù)的影響大于電位影響，成為主要因素。

（4）微生物的體積和形狀系數(shù)對此過程的影響明顯不同，且方向相反。

回歸結(jié)果說明，微生物表面參數(shù)與吸附－解吸參數(shù)有密切關(guān)系，在進(jìn)行理論解釋的基礎(chǔ)上建立數(shù)學(xué)關(guān)系，尋找某類微生物的通用遷移方程是可能的。

4 結(jié) 論

表1 不同微生物的物性及其吸附解吸常數(shù)

（1）對巨大芽孢桿菌在土壤中遷移的模型方程中重要參數(shù)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，得到其水動力彌散系數(shù)為3.2×10－6cm2／s，吸附常數(shù)為1.221×10－3，解吸常數(shù)為1.639×10－4，生長衰亡項(xiàng)系數(shù)為3.97×10－9。由于生長衰亡項(xiàng)系數(shù)比吸附解吸項(xiàng)系數(shù)小得多，則可忽略巨大芽孢桿菌的生長對其在土壤中運(yùn)移的影響。對后續(xù)研究巨大芽孢桿菌降解菲的研究有重要意義。

（2）Freundlieh平衡吸附方程可以更好地描述巨大芽孢桿菌、大腸桿菌及微球菌在土壤中的吸附行為，線性平衡吸附方程可以更好地描述金黃色葡萄球菌在土壤中的吸附行為。Freundlieh平衡吸附方程和線性平衡吸附方程描述假單胞菌及枯草芽孢桿菌在土壤中的吸附行為相當(dāng)。

（3）微生物體積越小，形狀系數(shù)越大，電位絕對值越高，吸附常數(shù)和解吸常數(shù)越大。

（4）微生物自身物理性質(zhì)對吸附影響能力由大到小依次為電位、形狀系數(shù)、粒徑，微生物自身物理性質(zhì)對解吸影響能力由大到小依次為形狀系數(shù)、電位、粒徑。

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