注射用鹽酸吉西他濱細菌內毒素檢查方法的研究

鄭 健，蘇五缺，趙 珊，閆隨朝*

（1.河北省石藥集團中奇制藥技術（石家莊）有限公司質量管理部，河北石家莊050000；

2.河北省制劑工程技術研究中心，河北石家莊050000）

·論 著·

注射用鹽酸吉西他濱細菌內毒素檢查方法的研究

鄭 健1，2，蘇五缺1，2，趙 珊1，2，閆隨朝1，2*

（1.河北省石藥集團中奇制藥技術（石家莊）有限公司質量管理部，河北石家莊050000；

2.河北省制劑工程技術研究中心，河北石家莊050000）

目的 研究注射用鹽酸吉西他濱對細菌內毒素檢查實驗的干擾情況，并建立其細菌內毒素檢查的質量標準。方法參照中國藥典細菌內毒素檢查法進行實驗，用2個不同廠家的鱟試劑對注射用鹽酸吉西他濱進行干擾實驗研究。結果通過調節樣品pH進行干擾實驗確證，按擬定標準檢查，三批供試品的細菌內毒素檢查結果均符合規定。結論可以用細菌內毒素檢查法（凝膠法）代替家兔熱原檢查法控制其產品質量。

鹽酸吉西他濱；內毒素類；方法

鹽酸吉西他濱是細胞周期特異性抗代謝類藥物，主要作用于DNA合成期的腫瘤細胞，即S期細胞，在一定條件下，可以阻止G1期向S期的進展［1］；對非小細胞肺癌、胰腺癌呈現客觀的療效［2］。目前國內檢查注射用鹽酸吉西他濱熱原的方法是家兔法［3］。由于家兔法存在生物學差異，設備要求高，加之注射用鹽酸吉西他濱毒性較大［4］。細菌內毒素檢查法可以克服以上缺點，且具有靈敏快速、簡便易行、重現性好等優點。筆者采用凝膠法對注射用鹽酸吉西他濱進行細菌內毒素檢查，對用該方法代替家兔熱原檢查法的可行性進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 細菌內毒素限值L的確定：內毒素限值為L= K/M，式中K為按規定的給藥途徑，人體每公斤體質量每小時最大可耐受的內毒素劑量，以EU/（kg·h）表示，注射劑K=5EU/（kg·h）；M為人體每公斤體質量每小時接受的最大給藥劑量。一般我國人群平均體質量按60kg計算，平均體表面積按1.62m2計算［5］。注射用鹽酸吉西他濱在單獨或聯

合用藥時，推薦劑量為按體表面積內毒素限值為1 000～1 250mg/m2，靜脈輸注30min。

按聯合用藥計算M=1 250mg/（m2·h）×1.62m2/60kg=33.8mg/（kg·h）。最終內毒素限值L=5EU/（kg·h）/33.8mg/（kg.h）=0.15EU/mg。國家標準WS1-（X-429）-2003Z中，注射用鹽酸吉西他濱內毒素的檢查方法為熱原法，按此方法，以國外產品為雙對照，測定我公司仿制注射用鹽酸吉西他濱內毒素限值為0.05EU/mg。

1.2 試劑：①注射用鹽酸吉西他濱，石藥集團中奇制藥技術（石家莊）有限公司，規格0.2g/支（以吉西他濱計），批號20110301、20110302、20110303。②鱟試劑，湛江安度斯生物有限公司，規格0.1mL，批號1008262，靈敏度0.125EU/mL；湛江博康海洋生物有限公司，規格0.1mL，批號1003270，靈敏度0.125EU/mL；湛江安度斯生物有限公司，規格0.1mL，批號1006042，靈敏度0.06EU/mL。③細菌內毒素工作標準品，中國藥品生物制品檢定所，規格1mL，批號150601-201070，效價140EU/支。④細菌內毒素檢查用水（BET水），湛江安度斯生物有限公司，規格100mL/瓶，批號1010120。⑤酸度調節劑，0.1mol/L氫氧化鈉溶液，稱取氫氧化鈉（批號20100624，天津永大化學試劑有限公司，分析純），用細菌內毒素檢查用水在除熱原的容器中配制成濃度為0.1mol/L的溶液。

1.3 實驗儀器設備及用具：內毒素檢測儀［（TAL-40D、能準確到（37±1）℃］、旋渦混合器（XW-80A）、電熱鼓風干燥箱（WGL-45B、溫度能達到250℃）、電子天平（型號AL204，感量0.1mg）、稱量瓶、刻度吸管、微量移液器、試管、試管架、洗耳球、封口膜、時鐘、剪刀、砂輪。

2 結 果

2.1 所用鱟試劑靈敏度復核

2.1.1 細菌內毒素標準溶液的制備：用細菌內毒素檢查用水將140EU/支細菌內毒素工作標準品復溶，制成0.25、0.125、0.06、0.03、0.015EU/mL等濃度的內毒素標準溶液。

2.1.2 待復核鱟試劑準備及加樣反應：取0.1mL/支的鱟試劑1008262、1003270、1006042批各18支，加入0.1mL內毒素檢查用水復溶，在已溶解的鱟試劑安瓿中分別加入2.0、1.0、0.5和0.25λ的內毒素溶液各0.1mL各4支，其余2支分別加入內毒素檢查用水0.1mL，用封口膜封口，混勻，將其垂直放入內毒素檢測儀中，保溫（60±2）min。

2.1.3 結果觀察：將鱟試劑管從內毒素檢測儀中輕輕取出，避免振動，將每管拿出緩緩倒轉180℃觀察，若管內形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（+）；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（-）。1008262、1003270、1006042的靈敏度均在0.5～2.0λ范圍內，均可用于干擾試驗和供試品的內毒素檢查。見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果Table 1 Sensitivity verification of TAL

2.2 干擾試驗預實驗

2.2.1 嘗試劑選擇：此實驗選擇λ=0.125EU/mL的鱟試劑（1008262批與1003270批）及λ= 0.06EU/mL的鱟試劑（1006042批）來進行實驗。

2.2.1.1 最低有效濃度（minimum valid concentration，MVC）的計算：MVC=λ/L=0.125EU/ mL÷0.05EU/mg=2.5mg/mL。

2.2.1.2 細菌內毒素標準品制備：同2.1.1操作，用內毒素檢查用水稀釋成4.0、2.0λ（0.5、0.25 EU/mL）濃度的溶液，記作E0.5、E0.25。

2.2.1.3 樣品制備：用內毒素檢查用水將樣品稀釋成下列濃度的溶液（80、40、20、10、5、2.5mg/mL），記作S80、S40、S20、S10、S5、S2.5。

2.2.1.4 供試品陽性對照的制備：0.5mLE0.5+ 0.5mL S80-1.0mL S40E0.25，0.5mLE0.5+0.5mL S40-1.0mL S20E0.25，0.5mLE0.5+0.5mL S20-1.0mL S10E0.25，0.5mLE0.5+0.5mL S10-1.0mL S5E0.25，0.5mLE0.5+0.5mL S5-1.0mL S2.5E0.25。

2.2.1.5 加樣反應：取鱟試劑復溶后，分別與2.2.1.3、2.2.1.4中溶液反應，同時做兩管陽性對照，兩管陰性對照。

2.2.1.6 結果：綜合以上反應結果得出，采用不同靈敏度鱟試劑進行實驗，均呈現明顯的干擾抑制。見表2。

表2 供試品干擾試驗預實驗結果Table 2 Results of inhibition or enhancement pre-test for products

2.2.2 調節pH值進行干擾預實驗：此實驗選擇λ=0.125EU/mL鱟試劑（1008262批）來進行實驗。

2.2.2.1 細菌內毒素標準品制備：同2.1.1操作，用內毒素檢查用水稀釋成4.0、2.0λ（0.5、0.25EU/mL）濃度的溶液，記作E0.5、E0.25。

2.2.2.2 樣品制備：用內毒素檢查用水和0.1mol/L氫氧化鈉溶液將樣品20110301溶解并調節pH值為7.0得到20mg/mL溶液，再稀釋成10、5、2.5mg/mL溶液，記作S20、S10、S5、S2.5。

2.2.2.3 供試品陽性對照的制備：0.1 mLE2.5+ 0.9mL S20-1.0mL S20E0.25，0.5mLE0.5+0.5mL S20-1.0mL S10E0.25，0.5 mLE0.5+0.5mL S10-1.0mL S5E0.25，0.5mLE0.5+0.5mL S5-1.0mL S2.5E0.25。

2.2.2.4 加樣反應：取鱟試劑復溶后，分別與2.2.2.2、2.2.2.3中溶液反應，同時做2管陽性對照，2管陰性對照。

2.2.2.5 結果：調節pH值至7.0后，該樣品在20mg/mL（S20）及以下濃度均無干擾。見表3。

表3 供試品干擾試驗預實驗結果Table 3 Results of inhibition or enhancement pre-test for products

2.3 干擾實驗：根據干擾預實驗結果可初步確定，選用靈敏度為0.125EU/mL的鱟試劑，以10mg/mL進行正式干擾實驗。

2.3.1 細菌內毒素標準品制備：同2.1.1操作，用內毒素檢查用水稀釋成4.0、2.0、1.0、0.5、0.25λ（0.5、0.25、0.125、0.06、0.03EU/mL）濃度的溶液，記作E0.5、E0.25、E0.125、E0.06、E0.03。另取7EU/mL內毒素標準溶液1.0mL加入細菌內毒素檢查用水1.8mL置旋渦。

混合器上混合30s，制成2.5EU/mL的內毒素標準溶液；取2.5EU/mL內毒素標準溶液1.0mL加入細菌內毒素檢查用水1.0mL置旋渦混合器上混合30秒，制成1.25EU/mL的內毒素標準溶液；依次制成0.6、0.3EU/mL溶液，記作E2.5、E1.25、E0.6、E0.3。

2.3.2 樣品制備：將3批樣品用內毒素檢查用水溶解后，用0.1mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0，再分別稀釋成濃度為20mg/mL的溶液備用，記作S20，稀釋步驟同2.2.2.2。

2.3.3 供試品的陽性對照的制備：0.5mL E0.5+ 0.5mL S20-1.0mL S10E0.25，0.5mL E0.25+0.5mL S20-1.0mL S10E0.125，0.5mL E0.125+0.5mL S20-1.0mL S10E0.06，0.5mL E0.06+0.5mL S20-1.0mL S10E0.03。

2.3.4 結果：采用2個廠家鱟試劑對3個批號注射用鹽酸吉西他濱進行干擾試驗，10mg/mL濃度下滿足0.5Es≤Et≤2Es，說明供試品在10mg/mL及以下濃度無干擾，可采用靈敏度為0.125EU/mL的鱟試劑進行該產品的細菌內毒素檢測。見表4。

表4 供試品干擾試驗結果Table 4 Results of inhibition or enhancement test for products

2.4 注射用鹽酸吉西他濱細菌內毒素檢查：將3批供試品分別加入內毒素檢查用水3mL溶解，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0，再用內毒素檢查用水稀釋成2.5mg/mL的溶液。用0.125EU/mL的鱟試劑，按2010版《中國藥典（二部）》［5］及《中國藥品檢驗標準操作規范》［6］，分別用2個廠家鱟試劑考察其內毒素限值，結果見表5。

表5 供試品細菌內毒素檢測結果Table 5 Results of bacterial endotoxin test for products

以上實驗結果表明，本品在10mg/mL及以下濃度下均無干擾，可采用細菌內毒素檢查法，取本品，加入內毒素檢查用水3mL使其溶解，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0，依法檢查［5］，吉西他濱中含內毒素的量應小于0.05EU/mg。

3 討 論

實驗評價了注射用鹽酸吉西他濱對鱟試劑與內毒素凝集反應是否有干擾作用，結果表明注射用鹽酸吉西他濱用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調節溶液pH值為中性后，按中國藥典2010年版二部附錄ⅪE細菌內毒素檢查法實驗，其20mg/mL及以下濃度對細菌內毒素檢查無干擾作用，我們將供試品使用靈敏度λ為0.25EU/mL的鱟試劑進行細菌內毒素檢查是可行的，確證了細菌內毒素法完全可以代替傳統的家兔法進行注射用鹽酸吉西他濱的熱原檢查。

注射用鹽酸吉西他濱的細菌內毒素檢查標準制定參考，取本品1支，加入內毒素檢查用水3mL使其溶解，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0，依法檢查（中國藥典2010年版二部附錄ⅪE）［5］，吉西他濱中含內毒素的量小于0.05EU/mg。

［1］ 趙可新，胡建平，單靖珊，等.鹽酸吉西他濱臨床應用進展［J］.中國醫藥導報，2006，3（36）：13-15.

［2］ 徐蕾，白中紅，許軟成.鹽酸吉西他濱加順鉑化療與三維適形放療同步治療局部中晚期非小細胞肺癌41例［J］.中國藥業，2010，19（15）：64-65.

［3］ 王明樂，劉俊芳.細菌內毒素檢測法與家兔法同步檢測磷酸川芎嗪注射液熱原的比較［J］.醫學信息，下旬刊，2010，23（2）：265.

［4］ 彭玲聰，陳潔瓊，瞿楊，等.注射用吉西他濱治療肺癌的不良反應觀察及對策［J］.海峽藥學，2011，23（7）：217-218.

［5］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）［M］.2010版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：99-101.

［6］ 中國藥品生物制品檢室所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規范［M］.2010版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：310-325.

（本文編輯：趙麗潔）

DETERM INATION OF GEMCITABINE HYDROCHLORIDE FOR INJECTION BYBACTERIAL ENDOTOXIN TEST

ZHENG Jian1，2，SUWuque1，2，ZHAO Shan1，2，YAN Suichao1，2*（1.Department of Quality Management，Hebei CSPC Zhongqi Pharmaceutical Technology（SJZ）Co.Ltd，Hebei Province，Shijiazhuang 050000，China；2.Hebei Province Pharmaceutical Engineering Technology Research Center，Hebei Provinice，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo create a quality standard of gemcitabine hydrochloride for injection by determination of bacterial endotoxin.MethodsReferring to the demands of testing methods which are recorded in Chinese Pharmacopoei（avolume 2010）.Gemcitabine hydrochloride for injection was examined by using two different brands of Tachypleus Amebocyte Lysate（TAL）.ResultsThe results of bacterial endotoxin test of three lots were all complied with the quality control of gemcitabine hydrochloride for injection.ConclusionThemethod of bacterial endotoxin test is accurate and reliable，and it can replace the rabbit pyrogen test.

gemcitabine hydrochloride；endotoxins；methods

R927.1

A

1007-3205（2013）07-0792-04

2012-08-06；

2012-11-21

科技部“十一五”重大新藥創制（2011ZX09401-306）

鄭?。?972-），女，河北石家莊人，河北省石藥集團中奇制藥技術（石家莊）有限公司醫藥工程師，醫學學士，從事藥物生產研發實驗室管理研究。

*通訊作者。E-mail：yanyuhanm@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.07.018